[发明专利]一种新型初级纤毛标记的转基因斑马鱼的构建方法及应用

权利要求书

1.一种新型初级纤毛标记的转基因斑马鱼的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，生物信息学分析获得斑马鱼肾消耗蛋白znphp3基因序列及其znphp3N端纤毛定位信号序列，znphp3基因序列如SEQ ID NO.1所示，znphp3N端纤毛定位信号序列如SEQ IDNO.2所示；

步骤2，通过Gibson组装的方法构建minitol2-β-actin-zNphp3N-mCherry双源表达载体，minitol2-β-actin-zNphp3N-mCherry双源表达载体的序列如SEQ ID NO.10所示；

步骤3，利用Tol2转座方法，显微注射将minitol2-β-actin-zNphp3N-mCherry双源表达载体和tol2 mRNA导入斑马鱼胚胎中，荧光筛选稳定遗传的后代，获得稳定转基因品系。

2.根据权利要求1所述的一种新型初级纤毛标记的转基因斑马鱼的构建方法，其特征在于，所述步骤2中通过Gibson组装的方法构建minitol2-β-actin-zNphp3N-mCherry双源表达载体，具体步骤如下：

步骤2.1，以斑马鱼cDNA和minitol2-mCherry载体为模板，通过PCR分别获得斑马鱼nphp3基因全长以及载体minitol2-mCherry全长，引物序列分别为：

SEQ ID NO.3：ATGGGTACGGCATCCTCTCTGGT；

SEQ ID NO.4：CCTTGATGCATTTGGCAGGGCGG；

SEQ ID NO.5：AGAGAGGATGCCGTACCCATATTTAAATTAAACTGGGCATCA；

SEQ ID NO.6：CCCTGCCAAATGCATCAAGGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGA；

PCR产物经回收后，按照Gibson组装试剂盒说明要求进行Gibson组装连接，连接产物经转化大肠杆菌，制备质粒，测序验证获得正确的中间载体minitol2-zNphp3N-mCherry；

步骤2.2，以步骤2.1获得的中间载体和载体p5E-β-actinpromoter为模板，PCR分别获得minitol2-zNphp3N-mCherry和β-actinpromoter DNA片段，引物序列分别为：

SEQ ID NO.7：AGTTTCTTCAAACTGGAATTATTTAAATTAAACTGGGCATCA；

SEQ ID NO.3：ATGGGTACGGCATCCTCTCTGGT；

SEQ ID NO.8：AATTCCAGTTTGAAGAAACTTTT；

SEQ ID NO.9：AGAGAGGATGCCGTACCCATGGCTGAACTGTAAAAGAAAGGGA；

PCR产物回收后同步骤2.1获得正确的最终双源转化载体minitol2-β-actin-zNphp3N-mCherry。

3.根据权利要求1所述的一种新型初级纤毛标记的转基因斑马鱼的构建方法，其特征在于，所述步骤3中荧光筛选稳定遗传的后代的具体步骤为：

步骤3.1，显微注射将minitol2-β-actin-zNphp3N-mCherry双源表达载体和tol2mRNA导入斑马鱼胚胎中制备转基因斑马鱼T₀代，经过荧光显微镜筛选高表达zNphp3N-mCherry的胚胎作为潜在的T₀代进行培养；

步骤3.2，T₀代经正常斑马鱼饲养方法培育至三月龄成鱼后，与AB进行测交，获得的胚胎经荧光显微镜筛选携带有红色荧光的胚胎，筛选获得的带有红色荧光的胚胎为T₁代；

步骤3.3，T₁代经正常斑马鱼饲养方法培育至三月龄为可稳定遗传的PC标记转基因斑马鱼。

4.一种新型初级纤毛标记的转基因斑马鱼的应用，其特征在于，在初极纤毛相关信号通路研究中的应用。

5.一种新型初级纤毛标记的转基因斑马鱼的应用，其特征在于，在PC和PC相关信号通路的疾病新药物筛选和评价中的应用。