[发明专利]重组VEGFB的制备方法与应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及重组VEGFB的制备方法与应用。本发明提供的重组VEGFB的制备方法主要包括重组VEGFB的纯化方法，包括包涵体溶解、亲和层析纯化、复性、凝胶过滤层析的步骤，纯化获得的重组VEGFB不仅具有良好的收率和纯度，并且具有良好的生理活性，对视网膜色素上皮细胞具有良好的保护作用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及重组VEGFB的制备方法与应用。

背景技术

血管内皮生长因子B(Vascular endothelial growth factor B，VEGF-B)是 人血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)成员之一。 VEGF-B基因位于11号染色体q13，基因全长为4000bp，包含8个外显子和6 个内含子；VEGF-B分为两种异构体，VEGF-B167含有80％以上的转录信息， 含有一个C末端结合域，使其能够隔离在细胞表面；另一个异构体VEGF-B186 还有一个疏水C末端，使其能够自由溶解。VEGF-B含有VEGF家族标志序列 PXCVXXX-RCXGCC，并且与VEGF-A有47％的氨基酸相同，但研究表明， VEGF-B并不具有促进血管形成的特性。虽然VEGFB在血管生成中没有直接作 用，但它与毛细血管直径和动脉大小的增加有关。此外，VEGFB在防止细胞 死亡和促进适应性肥大方面有重要作用。最新研究表明VEGF-B可上调多种抗 氧化基因表达，能抑制在氧化应激作用导致的细胞死亡；VEGF-B基因敲除小 鼠的氧化相关基因上调及视网膜退行性病变。而加入VEGF-B蛋白治疗，会使 抗氧化基因表达上调，从而降低了视网膜细胞凋亡率。另外，VEGFB可以改 善包括神经系统在内的各种组织的存活率，其作用主要体现在外周神经元上。

目前，对VEGFB的人工合成的研究较少，且有报道称以基因工程的方法 制备的重组VEGFB多会以包涵体形式表达。总所周知，包涵体的纯化与复性 步骤通常非常复杂。一些报道中，对VEGFB包涵体的春华采用亲和层析 (Chelating Sepharose Fast Flow)，经复性后采用阳离子交换层析 (SP-Sepharose)，再经过透析后采用亲水层析(Polyhydroxymethyl A hydrophilic column)分离单倍体及二聚体。但该方法步骤较多，且工艺复杂， 回收率和纯度皆不理想。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供重组VEGFB的制备方法与 应用，该方法步骤简捷，能够实现重组VEGFB的快速回收，且回收率和纯度 皆高。

本发明提供的试剂组合，包括包涵体溶解液、平衡液1、平衡液2、平衡 液3、洗脱液和复性液；

所述包涵体溶解液包括水和Tris 1.1～1.3mg/mL，NaH₂PO₄.2H₂O 15～16 mg/mL，DTT 3.0～3.2mg/mL和盐酸胍5.5～6.0g/L，pH值为8.3～8.7；

所述平衡液1包括水和Tris 120～125mg/L，NaH₂PO₄.2H₂O 1.5～1.6g/L， 盐酸胍57～58g/L，pH值为8.3～8.7；

所述平衡液2包括水和尿素350～370g/L，NaH₂PO₄.2H₂O 15～16g/L，Tris 1.1～1.3g/L，pH值为6.3～6.7；

所述平衡液3包括水和尿素350～370g/L，NaH₂PO₄.2H₂O 15～16g/L，Tris 1.1～1.3g/L，pH值为5.5～6.0；