[发明专利]一种西番莲无菌外植体的培育方法

说明书

本发明提供了一种西番莲无菌外植体的培育方法，涉及植物组培技术领域，包括以下步骤：采集西番莲幼嫩茎段作为外植体，冲洗后采用饱和洗衣粉液浸泡，漂洗，得预处理外植体；采用利福平溶液对预处理外植体进行无菌预培养，得到预培养外植体；将所述预培养外植体剪切成茎段后进行消毒处理，得到无菌茎段；将所述无菌茎段在MS基本培养基中进行培养，获得无菌西番莲外植体。本发明所述的培育方法通过外植体的两次预处理方法，升汞杀菌方法及时间等结合，在降低污染率的同时也降低了因消毒灭菌导致的褐化率和死亡率，从而大大提高了外植体的存活率，降低了组培的生产成本。

技术领域

本发明涉及植物组培技术领域，尤其涉及一种西番莲无菌外植体的培育方法。

背景技术

西番莲(Passifloracaerulea L.)是典型的热带、亚热带浆果类果树，属于西番莲科(Passifloraceae)西番莲属(Passiflora L.)，是一种多年生常绿藤本植物。西番莲果实具有独特而浓郁的芳香气味，酸甜可口，是著名的果汁用热带水果，有“果汁之王”的美誉。西番莲的组培技术到目前为止还难以推广应用于种苗繁育，其中主要原因之一就是外植体消毒难，尤其是从野外田间采集的外植体，由于表面和内部都携带一定数量的细菌和真菌，尤其是内生菌。目前开展的西番莲组织培养技术的研究以西番莲茎段为外植体，消毒均采用2％次氯酸钠、0.1％～0.2％升汞两种消毒剂，消毒时间为10～20min。结果是升汞的消毒效果明显优于次氯酸钠。所以，现有西番莲外植体消毒灭菌技术中通常选用0.1％～0.2％的升汞进行10～20min的消毒灭菌。但是，其仍存在下述缺点：1.随着消毒剂浓度或消毒时间的增加，污染率呈下降趋势，而死亡率和褐化率呈上升趋势，存活率呈下降趋势。2.内生菌很难根除，随着继代次数的增加，内生菌污染也随之严重。

发明内容

本发明的目的在于提供一种西番莲无菌外植体的培育方法，在降低污染率的同时也降低了因消毒灭菌导致的褐化率和死亡率，大大提高了外植体的存活率，降低了组培的生产成本。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种西番莲无菌外植体的培育方法，包括以下步骤：

采集西番莲幼嫩茎段作为外植体，冲洗后采用饱和洗衣粉液浸泡，漂洗，得预处理外植体；

采用利福平溶液对预处理外植体进行无菌预培养，得到预培养外植体；

将所述预培养外植体剪切成茎段后进行消毒处理，得到无菌茎段；

将所述无菌茎段在MS基本培养基中进行培养，获得无菌西番莲外植体。

优选的，所述外植体的长度为12～15cm，保留有3～4个腋芽、顶芽及顶芽上端的1～2片叶。

优选的，所述外植体浸泡的时间为10～30min。

优选的，所述漂洗的次数为2～4次。

优选的，所述利福平溶液的浓度为80～120mg/L，外植体浸入利福平溶液中2～3cm。

优选的，所述预培养温度为22～30℃，光照时间为8～12h/d，时间为2～4d。

优选的，所述无菌茎段长为0.8～2.0cm，带有1～2个腋芽。

优选的，无菌茎段消毒处理的具体方式为：采用体积分数为75～90％的酒精消毒处理10～60s，再采用质量浓度为0.05～0.15％的升汞表面消毒10～12min，冲洗3～5次。

优选的，在MS基本培养基中培养8～12d，培养温度为25～28℃，光照强度为1000～2000lux，光照时间为8～12h/d。

优选的，所述每接种一个茎段需要25～30ml MS基本培养基。