[发明专利]一种基于磁珠的RNA pull down新方法

说明书

本发明公开了一种基于磁珠的RNA pull down新方法，包括如下步骤：1）体外转录获得目的RNA；2）制备寡核苷酸或单个核苷酸磁珠；3）制备目的RNA磁珠复合物；4）捕获目的RNA‑蛋白复合物；5）收集目的RNA‑蛋白复合物，用于后续分析（WB、银染、质谱等）。本发明利用体外转录获得的目的RNA，还原其在细胞内的真实结构；目的RNA与磁珠上的核苷酸的连接稳定，不会形成混连；避免了在游离状态下目的RNA末端连接生物素标记的单个核苷酸所造成的生物素数量过多的弊端；本发明无需在目的RNA与生物素标记的核苷酸连接后进行纯化，节约了时间和成本。

技术领域

本发明涉及一种基于磁珠的RNA pull down新方法及试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

细胞内分子间的相互作用是细胞信号转导的基础。要阐明细胞生物学功能的分子机制避不开研究分子间的相互作用，进而弄清信号转导过程，从而理解其分子机理并找到干预疾病进程的靶点。近年来，越来越多的研究表明RNA特别是长链非编码RNA（longnoncoding RNA, lncRNA）与蛋白的相互作用能够调控蛋白的稳定性、修饰、转位等。目前研究lncRNA与蛋白的相互作用主要有如下方法：1）RNA pull down方法（以Thermo公司的Pierce^TM Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit为代表），以RNA为主要研究对象，采用此方法可找到与RNA相互作用的蛋白分子；2）RNA immunoprecipitation (RIP)方法（以Millipore公司的 Magna RIP^TM RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit为代表），以蛋白为主要对象，采用此方法找到与蛋白相互作用的RNA分子。

目前的RNA pull down试剂盒主要基于链霉亲和素与生物素的亲和结合原理，以生物素标记的单个核苷酸为原料，体外转录获得带生物素标记的目的RNA，进而与样品蛋白结合，再与链霉亲和素磁珠结合；在目的RNA或RNA/DNA探针末端连接生物素标记的单个核苷酸，进而与链霉亲和素磁珠结合，再与样品蛋白结合，通过磁分离将带生物素标记的RNA及其复合物分离出来。目前主要有以下三种方法：

1. 探针法：利用生物素标记的RNA或DNA探针捕获其靶向的RNA及复合物，CN106168615A中阐述了这种方法：针对目标区域设计特异性RNA探针，探针经过脱硫生物素标记；链霉亲和素偶联在磁珠上，并和脱硫生物素亲和结合；细胞全蛋白与磁珠-探针复合物孵育，作用蛋白分子可以和RNA探针特异性结合。经过洗涤去除非特异性结合蛋白分子，最后洗脱得到目的探针-蛋白复合物。该方法的优势在于可捕获内源性的RNA分子及复合物；不足在于：1）针对每个不同的目的RNA，都需要重新设计能够捕获目的RNA的生物素标记探针，因此该试剂盒需定制而非通用；2）探针可能存在非特异性捕获，探针可能同时靶向目的RNA或其他RNA，这是探针自身的局限所导致的；3）探针可能无法捕获目的RNA及其复合物或仅捕获游离的目的RNA，因为细胞内RNA与蛋白或其他分子形成复合物以后，目的RNA暴露在外的结构不明确，如果探针靶向的RNA部位在复合物中并未暴露，则会导致探针无法捕获目的RNA及其复合物。CN 106168615A中阐述针对目标区域设计特异性RNA探针，然后用这段探针去与细胞全蛋白孵育，进而获得目的探针-蛋白复合物，该描述指出RNA探针可能直接与蛋白形成复合物，而非捕获目的RNA及其蛋白复合物，因此进一步指出RNA探针本身的局限性。