[发明专利]一种基于磁珠的RNA pull down新方法

权利要求书

1.一种基于磁珠的RNA pull down方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)体外转录获得目的RNA；

2)制备寡核苷酸磁珠；

3)制备目的RNA磁珠；

4)捕获目的RNA-蛋白复合物；

5)收集目的RNA-蛋白复合物；

所述步骤2)寡核苷酸磁珠的制备方法为：将生物素标记的寡核苷酸与链霉亲和素磁珠在核苷酸捕获缓冲液中孵育，采用旋转混合仪持续混匀，孵育时间为30min-120min，孵育温度为15℃-37℃，通过生物素与链霉亲和素的亲和力将寡核苷酸固定至磁珠表面，经过磁分离、洗涤获得寡核苷酸磁珠，核苷酸捕获缓冲液pH 7.0-7.5，包括：10-50mM Tris、0.5-1MNaCl、1-5mM EDTA，洗涤缓冲液pH 7.0-7.5，包括：10-50mM Tris、10-50mM NaCl、0.1％-1％吐温20；

所述步骤2)中的寡核苷酸为人工合成的含5-30个碱基的寡核苷酸，其构成的碱基为A、U、C、G，其末端的1-3个碱基上带有生物素，具体方法为用带生物素的核苷酸合成寡核苷酸末端的1-3个核苷酸；

所述步骤3)制备目的RNA磁珠复合物的方法为：将步骤2)所得核苷酸磁珠，通过RNA连接酶在RNA连接缓冲溶液中将目的RNA与磁珠上的寡核苷酸连接，采用旋转混合仪持续混匀，连接时间为0.5h-24h，连接温度为4℃-37℃，经过磁分离洗涤获得目的RNA磁珠，RNA连接缓冲溶液pH 7.0-7.5，包括：10-50mM Tris，10-50mM MgCl₂，1-5mM DTT，10-50mM ATP，0.1％-1％BSA，10％-30％PEG 6000或PEG 8000；

所述步骤4)捕获目的RNA-蛋白复合物的方法为：将步骤3)得到的目的RNA磁珠在RNA-蛋白结合缓冲溶液中与样品蛋白进行孵育，采用旋转混合仪持续混匀，孵育时间为30min-120min，孵育温度为4℃-37℃，经过磁分离洗涤获得目的RNA-蛋白磁珠复合物，RNA-蛋白结合缓冲溶液pH 7.0-7.5，包括：10-50mM Tris、0.5–1M NaCl、10–50mM MgCl₂、0.1％-1％吐温20。

2.根据权利要求1所述的一种基于磁珠的RNA pull down方法，其特征在于：

所述步骤1)体外转录获得目的RNA的方法为：针对不同目的RNA的研究，通过人工设计，合成或引物扩增相应的DNA模板，在获得纯化的DNA模板后通过体外转录、纯化获得目的RNA。

3.根据权利要求1所述的一种基于磁珠的RNA pull down方法，其特征在于，所述步骤5)收集目的RNA蛋白复合物的方法为：将步骤4)得到的目的RNA-蛋白磁珠复合物，加入1-5mM生物素洗脱液进行洗脱；采用旋转混合仪持续混匀，孵育时间为30min-120min，孵育温度为15℃-37℃，经过磁分离洗涤收集上清即为目的RNA-蛋白复合物，用于后续的蛋白质印迹、银染、质谱分析。