[发明专利]重组前融合状态新冠刺突蛋白的制备方法

说明书

本发明披露了利用弗林基因敲除或着敲低的哺乳动物细胞(如HEK293,CHO或者其他哺乳动物细胞)生产重组前融合状态的新冠刺突蛋白的技术。前融合状态的新冠刺突蛋白可以作为抗原产生抗体/结合分子，用以制备检测分析或诊断的试剂，或者判断检测对象是否为新型冠状病毒既往感染者。该蛋白还可以用作干扰新冠病毒与受体结合的抑制剂；或者用于制备具有治疗效果的新冠病毒抗体/结合分子；同时还可以用作能够对SARS‑CoV‑2病毒产生免疫力的疫苗。除此之外，该蛋白也可以用作能够对SARS‑CoV‑2相关冠状病毒产生预防性或治疗性的药物。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及重组前融合状态新冠刺突蛋白的制备方法。

背景技术

新冠病毒主要通过其刺突蛋白与受体血管紧张素转化酶2(ACE2)结合，从而进入人体细胞。

SARS-CoV-2有四种主要的结构蛋白，分别为S(刺突蛋白)、E(包膜蛋白)、M(膜蛋白)和 N(核衣壳蛋白)。其中，核衣壳蛋白包裹RNA基因组，刺突蛋白、包膜蛋白和膜蛋白一起构成病毒外膜。刺突蛋白(S)使病毒颗粒与宿主细胞的细胞膜吸附并融合，实现病毒与宿主受体的结合。

刺突蛋白是一种I型融合蛋白，具有融合前三聚体和融合后三聚体两种构象，包含两个不同功能的亚基S1和S2。其中，S1亚基负责与宿主受体细胞结合，S2亚基介导病毒包膜与宿主细胞膜的融合，从而使得病毒遗传物质能够进入宿主细胞。刺突蛋白有两种形式，分别为前融合形式和被蛋白酶酶切激活后的成熟/活性形式。

重组的SARS-CoV-2结构蛋白对抗体、疫苗和药物研发至关重要。但是，重组野生型S-ECD(胞外域)非常不稳定，导致重组蛋白的生产极为困难。目前市场上大多数的重组S-ECD都是通过突变来解决被蛋白酶酶切的问题，但是这样就导致得到的重组蛋白与野生型不同，即得到了非天然结构的蛋白。而非天然结构的蛋白在科研和治疗中一般不会被接受。

S蛋白的酶切水解是病毒入侵宿主细胞必经的过程，它可能发生在组成型细胞分泌通路上，也可能发生在病毒进入宿主细胞期间。

弗林蛋白酶是一种能够将底物蛋白切割成成熟/活性形式的内切酶，它的底物包括凝血因子、血清蛋白、生长因子受体以及病毒刺突蛋白。弗林蛋白酶属于类枯草杆菌蛋白酶前体蛋白转换酶家族，该家族的成员能够将潜在的前体蛋白转换成其生物活性产物。弗林蛋白酶一般富集在高尔基体中，并在高尔基体中将其他底物蛋白切割或激活成相应的成熟/活性形式。弗林蛋白酶是S蛋白的一种前体蛋白转换酶。

因此，如果借助弗林蛋白酶来抑制或阻止S蛋白的酶解，也许能够制备出前融合状态蛋白 (S-ECD-PFS)。S-ECD-PFS可以作为抗原产生抗体，用以制备检测分析或诊断的试剂；或者用作干扰SARS-CoV-2病毒进行细胞结合的抑制剂；或者作为抗原用于制备SARS-CoV-2的单克隆抗体；或作为疫苗激发受体对SARS-CoV-2的免疫力。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了重组前融合状态新冠刺突蛋白的制备方法，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明是这样实现的，一种制备前融合状态的重组SARS-CoV-2刺突蛋白的方法，包括：使用CRISPR Cas9转染技术制备无法表达弗林蛋白酶但能表达SARS-CoV-2刺突蛋白的宿主细胞，使用的sgRNA支架序列为：GATGCGCACAGCCCACGTGT，如SEQ ID NO:19所示和ACAGTGTGGCACGGAAGCAT，如SEQ ID NO:20所示；

在宿主细胞中表达SARS-CoV-2刺突蛋白。

进一步地，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

进一步地，所述宿主细胞是HEK293细胞。

进一步地，所述sgRNA被整合至载体中。