[发明专利]一种植物提取物制备方法

说明书

本发明提供了一种植物提取物制备方法。该技术方案根据目标成分的物性特点设计了全新的工艺流程。具体来看，本发明首先采用两次发酵的方法制备植物活细胞素，二次发酵促进有效成分转化，同时以添加了植物活细胞素的蛋白胨发酵液强化工程菌发酵。本发明使目的蛋白得到有效纯化和充分富集，通过发酵方法使玫瑰成分的护肤功效得到显著提升，而且，本发明工艺合理，收率较高，适合规模化生产，具有突出的技术优势。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种植物提取物制备方法。

背景技术

玫瑰是蔷薇目、蔷薇科、蔷薇属的落叶灌木。枝杆多针刺，奇数羽状复叶，小叶5-9片，椭圆形，有边刺。花瓣倒卵形，重瓣至半重瓣，花有紫红色、白色，果期8-9月，扁球形。玫瑰是所有花卉中最著名和最受欢迎的一种，除了有着芳香气息之外，还具有确切的护肤功效，因此玫瑰提取物在护肤品中应用非常广泛。

玫瑰护肤是利用玫瑰进行皮肤保养的一种方式，含有玫瑰成分的美容产品，依靠玫瑰香气达到舒缓、放松、愉悦等作用，同时，玫瑰花中含有300多种化学成份，如芳香的醇、醛、脂肪酸、酚和含香精的油和脂，对皮肤具有滋养、抗衰老等功效。然而，近年来应用表明，天然玫瑰提取物的功效性仍有待提高。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种植物提取物制备方法，以解决常规玫瑰提取物的护肤功效有待提高的技术问题。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种植物提取物制备方法，包括以下步骤：

利用鲜花乳杆菌对玫瑰花进行发酵，对所得的发酵液进行浓缩，而后二次发酵、纯化，得到鲜花素精提液，经冷冻干燥后得到活细胞素；

第一天：预先接种10μl原种于3-4ml LB试管中，37℃震荡培养过夜；8:00am取复苏的原种，转接到50LB，37℃放大培养；2:00pm将放大培养的菌种分别按1ml一瓶接种到6×120ml LB的500ml三角瓶，30-32℃培养到对数期，事先将水浴摇床温度调整到42℃，将培养到对数期细菌放置在42℃水浴摇床，振荡培养诱导18小时；

第二天：8:00am收集发酵液，离心收集细菌沉淀，并合并在一个离心管中；离心前留取1ml菌液4℃放置备用；用50mlPB悬菌，冰浴超声破碎，离心收集包涵体沉淀；1M NaCl洗包涵体1次，PB洗1次，每次洗涤包含体时要充分吹打，形成均一悬液，离心收集包涵体沉淀；40ml H7.4PBp悬起包涵体，并添加1％的巯基乙醇，逐渐添加尿素粉末，边加边搅，直到澄清，离心，取上清用于进一步的蛋白纯化，保留1ml溶解的包涵体4℃保存备用；准备镍柱，装柱8ml-10ml镍柱，上样，根据样品中的目的蛋白含量上样，本实验全部上柱；上样后流出的为非特异性洗脱的穿过峰约60ml；用20mM咪唑6M尿的PB洗40ml体积，为20mM咪唑浓度特异性洗脱组分约40ml；不同浓度特异性洗脱，每个浓度咪唑至少洗5个柱体积；电泳检测，各组分4℃保存，电泳检测后确定目的蛋白组分，进行透析；将所有样品组分进行SDS-PAGE电泳检测，12％分离胶，4％浓缩胶，14V预电泳5min，160V电泳，约45-60min，结束，染色过夜，第二天脱色看结果；

第三天：根据电泳结果，对目的蛋白组分进行透析和复性，每4小时换次透析液；继续透析，透析过夜；

第四天：测定蛋白浓度，用PB和甘油调整到1mg/ml；分装成液体或将液体冷冻干燥。

其中，第一天所述的37℃放大培养，其接种量1:100，放大体积至少是发酵体积的1％。

第一天所述的500ml三角瓶，其装液量为120ml。

第二天所述的冰浴超声破碎，处理条件为：15s超声，30s停止，超声40min。

第四天对蛋白浓度的测定是利用紫外法实现的。