[发明专利]一种植物提取物制备方法

权利要求书

1.一种植物提取物制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用鲜花乳杆菌对玫瑰花进行发酵，对所得的发酵液进行浓缩，而后二次发酵、纯化，得到鲜花素精提液，经冷冻干燥后得到活细胞素；

第一天：预先接种10μl原种于3-4ml LB试管中，37℃震荡培养过夜；8:00am取复苏的原种，转接到50LB，37℃放大培养；2:00pm将放大培养的菌种分别按1ml一瓶接种到6×120mlLB的500ml三角瓶，30-32℃培养到对数期，事先将水浴摇床温度调整到42℃，将培养到对数期细菌放置在42℃水浴摇床，振荡培养诱导18小时；

第二天：8:00am收集发酵液，离心收集细菌沉淀，并合并在一个离心管中；离心前留取1ml菌液4℃放置备用；用50mlPB悬菌，冰浴超声破碎，离心收集包涵体沉淀；1M NaCl洗包涵体1次，PB洗1次，每次洗涤包含体时要充分吹打，形成均一悬液，离心收集包涵体沉淀；40mlH7.4PBp悬起包涵体，并添加1％的巯基乙醇，逐渐添加尿素粉末，边加边搅，直到澄清，离心，取上清用于进一步的蛋白纯化，保留1ml溶解的包涵体4℃保存备用；准备镍柱，装柱8ml-10ml镍柱，上样，根据样品中的目的蛋白含量上样，本实验全部上柱；上样后流出的为非特异性洗脱的穿过峰约60ml；用20mM咪唑6M尿的PB洗40ml体积，为20mM咪唑浓度特异性洗脱组分约40ml；不同浓度特异性洗脱，每个浓度咪唑至少洗5个柱体积；电泳检测，各组分4℃保存，电泳检测后确定目的蛋白组分，进行透析；将所有样品组分进行SDS-PAGE电泳检测，12％分离胶，4％浓缩胶，14V预电泳5min，160V电泳，约45-60min，结束，染色过夜，第二天脱色看结果；

第三天：根据电泳结果，对目的蛋白组分进行透析和复性，每4小时换次透析液；继续透析，透析过夜；

第四天：测定蛋白浓度，用PB和甘油调整到1mg/ml；分装成液体或将液体冷冻干燥。

2.根据权利要求1所述的一种植物提取物制备方法，其特征在于，第一天所述的37℃放大培养，其接种量1:100，放大体积至少是发酵体积的1％。

3.根据权利要求1所述的一种植物提取物制备方法，其特征在于，第一天所述的500ml三角瓶，其装液量为120ml。

4.根据权利要求1所述的一种植物提取物制备方法，其特征在于，第二天所述的冰浴超声破碎，处理条件为：15s超声，30s停止，超声40min。

5.根据权利要求1所述的一种植物提取物制备方法，其特征在于，第四天对蛋白浓度的测定是利用紫外法实现的。