[发明专利]检测半滑舌鳎TLR2和NF-κB基因表达水平的引物及方法

说明书

本发明公开了一种用于非诊断目的检测半滑舌鳎TLR2和NF‑κB基因表达水平的实时荧光定量PCR的引物，所述引物包括半滑舌鳎TLR2和NF‑κB基因的特异性上、下游引物。本发明引物能够实现对半滑舌鳎TLR2和NF‑κB基因的特异性扩增，对材料中非目的基因没有扩增信号，可对半滑舌鳎TLR2和NF‑κB基因表达水平的变化情况实施定量检测，其操作简单，可重复性高，特异性强，灵敏度好，无需使用荧光探针，检测过程准确高效，应用前景广阔。能够检测半滑舌鳎TLR2和NF‑κB基因的表达水平，为TLR2和NF‑κB基因的功能研究奠定基础。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，是一种检测半滑舌鳎TLR2和NF-κB基因表达水平的实时荧光定量PCR的引物及方法。

背景技术

TLR2是Toll样受体(Toll-liκe receptors，TLR)家族的一员，可以识别来源于微生物的保守分子结构，当微生物突破机体的物理屏障时，TLR可以识别它们并激活机体产生免疫细胞应答，在机体的天然免疫防御中起重要作用。TLR2具有广泛的从病毒到寄生生物的识别谱，可识别革兰氏阳性菌的肽聚糖和脂磷壁酸，革兰氏阴性菌细胞壁的脂蛋白和脂肽聚糖，革兰氏阴性菌、螺旋菌和支原体细胞膜的脂蛋白和脂肽，霉菌的细胞壁成分，真菌的酵母聚糖，某些寄生生物，原生动物细胞膜的糖脂及病毒等。其最突出的生物学功能就是直接或间接地促进炎症因子的合成与释放，具有显著的抗菌抗病毒作用。因此，TLR2基因的表达水平能够间接地反应出鱼体是否受到微生物的外来刺激，是否诱导了免疫应答的发生。

NF-κB基因在鱼类先天性免疫应答中发挥重要的调控作用，控制机体多条重要的免疫信号通路，产生免疫效应因子来抵御外界的病原刺激，因此其调节表达与微生物感染和免疫刺激有关。研究其在鱼类中的表达情况，将有利于进一步阐明鱼类对病原刺激的免疫应答模式，为深入了解鱼类的先天性免疫奠定基础。

文献报道多集中在人或果蝇、小鼠等模式生物的TLR2和NF-κB基因的研究，其在鱼类上的免疫应答模式尚未探究清楚，那么建立一种可靠的、高效的基因表达水平检测方法就具有重要意义。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种用于非诊断目的检测半滑舌鳎TLR2和NF-κB基因表达水平的实时荧光定量PCR的引物，所述引物包括半滑舌鳎TLR2和NF-κB基因的特异性上、下游引物；

其中，半滑舌鳎TLR2基因的特异性上、下游引物序列如下：

TLR2 F：SEQ ID NO.1：TGTTACGGTTTGACTGGCGT

TLR2 R：SEQ ID NO.2：AAGATTGGGCATGTAGCCCC

半滑舌鳎NF-κB基因的特异性上、下游引物序列如下：

NF-κB F：SEQ ID NO.3：AGCTACGAGGTCTCAGGAGG

NF-κB R：SEQ ID NO.4：CCTCTACAGTGGAGCCTTGC

一种利用上述引物组用于非诊断目的检测半滑舌鳎TLR2和NF-κB基因表达水平的实时荧光定量PCR的方法，步骤如下：

(1)逆转录合成得到半滑舌鳎肝脏组织cDNA第一链；

(2)分别以TLR2 F和TLR2 R、NF-κB F和NF-κB R为引物，用实时荧光定量PCR法检测TLR2和NF-κB基因的表达水平；

进一步地，所述步骤(1)具体为：

以半滑舌鳎组织的总RNA(500ng左右)为模板，逆转录合成得到半滑舌鳎组织cDNA第一链。