[发明专利]一种天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料的制备方法

说明书

本发明公开了一种天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料的制备方法，属于用于组织或器官修复与再生的生物材料技术领域。本发明的制备方法包括将幼年大白猪股骨远端的骺软骨联合骨经漂洗、反复冻融、含TritonX‑100的PBS缓冲液、含SLES的PBS缓冲液、含HTHOPS的PBS缓冲液、含DNaseⅠ的PBS缓冲液和生理盐水处理，获得脱细胞骺软骨联合骨材料。本发明将骺软骨联合骨材料进行彻底的脱细胞处理后，在完全除去具有免疫原性的细胞及细胞内容物成分的同时，最大程度地保留了骺软骨联合骨ECM的完整性，并具有修复骨软骨缺损的能力，可用于治疗骨软骨缺损导致的骨科疾病。

技术领域

本发明涉及用于组织或器官修复与再生的生物材料技术领域，更具体的说是涉及一种天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料的制备方法。

背景技术

目前随着中国逐步进入老龄化社会，骨关节炎及剧烈活动引起的软骨损伤及软骨缺损等疾病日益影响人类健康，对个人造成沉重的经济及身心负担，并造成了沉重社会负担，是骨科临床亟待解决的难题。而针对上述难题，目前传统的解决方案包括关节镜修复手术、骨关节置换术等仍存在诸多问题，如修复效果欠佳、手术创伤巨大等问题。近年来采用生物材料修复软骨组织缺损受到了广泛关注，但目前的生物材料除了可能存在的生物相容性不良和软骨修复再生不足，还存在着修复目标仅聚焦于单纯透明软骨的问题。众所周知，骨关节炎及软骨的损伤不仅累及透明软骨自身，还累及软骨下骨，因此在对骨关节炎和软骨缺损修复治疗中，需要综合修复透明软骨及软骨下骨。研发具有促进软骨联合骨再生的生物材料成为了当前治疗骨关节炎及软骨缺损亟需突破的瓶颈。

骺软骨在长骨的两端，二次骨化中心即在其中出现。环绕在二次骨化中心周围的骺软骨中间层，在正常生物体中，骺软骨最终分化成骨组织使得骨骺闭。但有研究发现，骺软骨贮备着一层软骨胚种细胞带，具有分化为软骨的潜力，因此骺软骨联合骨存在修复软骨联合骨缺损的能力。

天然组织来源的细胞外基质可以促进细胞粘附、生长、迁移并引导细胞向骨组织分化，是近年来骨组织工程研究的重点。天然组织脱细胞材料因其结构和组成成分与生物机体高度相似而具有独特的生物相容性，因此表现出优异的组织修复效果。运用脱细胞技术制备细胞外支架为组织修复再生材料的制备提供可行思路。而目前能用于修复软骨联合骨的生物材料较少见报道，而骺软骨联合骨修复骨关节炎及软骨缺损则未见报道。

因此，提供一种天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料的制备方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料的制备方法，制备得到的骺软骨联合骨脱细胞材料是一种具有良好材料特性、优越的生物相容性和优异的骨软骨修复效果的生物材料，为修复软骨缺损及治疗骨关节炎提供一种新的材料和途径。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料的制备方法，具体步骤如下：

(1)取新鲜3-4月龄大白猪(雌雄不限)股骨远端骺软骨联合骨组织，在4℃低温环境下用无菌PBS反复漂洗5次，每次10min；去除材料上的血液、组织液；

(2)在有机溶剂中，置于恒温25℃、转速为60rpm的恒温摇床中震荡脱脂2-6h；后用无菌PBS冲洗12h；所述有机溶剂为质量浓度为50-70％乙醇溶液或20-40％丙酮溶液；

(3)置于液氮30min后，再迅速取出放置于37℃水浴30min；上述过程重复3次，最后用无菌PBS漂洗2次，每次5min；

(4)在体积浓度为1-2％的含Triton X-100的PBS缓冲液中加入混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡24-72h；再用无菌PBS冲洗12h；