[发明专利]一种天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料的制备方法在审
| 申请号： | 202110962367.1 | 申请日： | 2021-08-20 |
| 公开（公告）号： | CN113577391A | 公开（公告）日： | 2021-11-02 |
| 发明（设计）人： | 林贤丰;张琪;范顺武 | 申请（专利权）人： | 浙江大学医学院附属邵逸夫医院 |
| 主分类号： | A61L27/36 | 分类号： | A61L27/36;A61L27/50 |
| 代理公司： | 北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 11465 | 代理人： | 崔自京 |
| 地址： | 310000 浙江省杭州市*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 天然 组织 来源 软骨 联合 细胞 材料 制备 方法 | ||
1.一种天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)取新鲜3-4月龄大白猪股骨远端骺软骨联合骨组织，在4℃低温环境下用无菌PBS反复漂洗5次，每次10min；
(2)在有机溶剂中，置于恒温25℃、转速为60rpm的恒温摇床中震荡脱脂2-6h；后用无菌PBS冲洗12h；所述有机溶剂为质量浓度为50-70％乙醇溶液或20-40％丙酮溶液；
(3)置于液氮30min后，再迅速取出放置于37℃水浴30min；重复3次；最后用无菌PBS漂洗2次，每次5min；
(4)在体积浓度为1-2％的含Triton X-100的PBS缓冲液中加入混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡24-72h；再用无菌PBS冲洗12h；
(5)在质量浓度为2-5％的含十二烷基醚硫酸钠磺酸的PBS缓冲液中加入混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡12-48h；再用无菌PBS冲洗12h；
(6)在质量浓度为1-2％的3-烯丙氧基-2-羟基-1-丙烷磺酸钠盐的PBS缓冲液中加入混合抗菌溶液，置于恒温25℃、转速为100rpm的恒温摇床中震荡6-12h；再用无菌PBS冲洗12h；
(7)在浓度为0.01mg/ml DNaseⅠ的PBS缓冲液中，加入混合抗菌溶液，37℃恒温水浴6-12h；
(8)在质量浓度为50-70％的乙醇中，置于恒温25℃、转速为120rpm的恒温摇床中震荡24-48h；
(9)在无菌生理盐水中，加入混合抗菌溶液，置于温度为37℃、转速为120rpm的恒温摇床中震荡12h，重复3次；得到天然组织来源的骺软骨联合骨脱细胞材料；
步骤(4)-(7)中，所述混合抗菌溶液中青霉素和链霉素的浓度分别为100U/ml，100μg/ml；青霉素和链霉素的体积比为1:1；PBS缓冲液和混合抗菌溶液的体积比为10:1；
步骤(9)中，所述混合抗菌溶液中青霉素和链霉素的浓度分别为100U/ml，100μg/ml；青霉素和链霉素的体积比为1:1；无菌生理盐水和混合抗菌溶液的体积比为10:1。
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