[发明专利]一种安全无毒的高通量无缝构建质粒的方法

说明书

本发明公开了一种安全无毒的高通量无缝构建质粒的方法，属于遗传工程领域。本发明通过优化组装溶液成分，排除现有方法中存在有毒试剂二硫苏糖醇，以及DNA聚合酶、DNA连接酶、NAD等较昂贵的试剂。由于不需要DNA纯化操作，使得该方法适用于基于96孔PCR板或96孔酶标板等的高通量操作平台。同时，太极组装4个片段构建质粒时，拥有95％以上的阳性率，在高通量构建质粒实验中，可以省略菌落PCR验证步骤，进一步简化高通量质粒构建流程。

技术领域

本发明涉及一种安全无毒的高通量无缝构建质粒的方法，属于遗传工程领域。

背景技术

快捷简便的无缝构建质粒是分子生物学的基础，随着分子生物学研究对大量数据的需求，高通量无缝构建质粒技术平台成为推动领域进步的关键。自发现第一个限制性内切酶，开发出基于酶切连接的质粒构建方法以来，随着技术的不断发展，目前形成了三种主流的质粒构建方法，包括吉布森组装(Gibson assembly)、金门组装(Golden gateassembly)和酿酒酵母体内组装。基于IIS型限制性内切核酸酶的金门组装可用于组装包含重复序列的多个片段。基于内源性重组酶的酿酒酵母组装方法适用于组装多个大片段。然而，金门组装需要酶切、连接、纯化等过程，操作复杂，且成本高。酿酒酵母体内组装由于需要涉及酿酒酵母特有的转化方法，且其生长较慢，不适于高通量构建质粒。2009年报道的吉布森组装组装方法，因其简便性和高效性成为常规基因克隆中使用最广泛的方法(DOI:10.1038/nmeth.1318)。

吉布森组装方法由T5核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶，以及Tris-HCl、镁离子、PEG8000 和DTT(二硫苏糖醇)组成。镁离子、Tris-HCl和PEG8000提供了酶反应条件，DTT作为强还原剂提供还原环境。首先由T5核酸外切酶将双链DNA切割获得3’端单链末端，之后DNA聚合酶修复不同片段间 3’端单链末端的缺口，最后由DNA连接酶进行连接。其中，T5核酸外切酶是吉布森组装方法的核心，且基于该酶的3’端单链末端退火构建质粒提供了极高的阳性率(大于90％)，所有基于T5核酸外切酶优化的方法均拥有约90％以上的阳性率。由于吉布森组装方法的高效性和简便性，2009年之后，有许多进一步的研究。2014年，有研究发现去除成本最高的DNA连接酶后并不会影响吉布森组装效率，被命名为Hot Fusion，使得成本大幅下降约90％，但是该方法反应液需要dNTP、NAD等，导致配置过程较复杂，并且需要添加有毒试剂DTT(《Hot Fusion:An Efficient Method to Clone Multiple DNAFragments as Well as Inverted Repeats without Ligase》)。此外，在公开号为CN107760706A的专利《DNA外切酶的应用及无缝克隆的方法》中所采用的组装方法，以及在公开号为CN 108841901A《一种依赖T5核酸外切酶和PEG8000 完成DNA组装的试剂盒及其应用》中命名为TEDA的组装方法，均是在Hot Fusion的基础上，进一步去除DNA聚合酶而成的组装方法。然而2016年有研究文献表明，在去除DNA聚合酶的情况下，会导致两个DNA片段的组装效率显著降低约70％(《Seamless Insert-Plasmid Assembly at High Efficiencyand Low Cost》)。本专利的结果进一步表明，当组装4个DNA片段时，若去除DNA聚合酶，会导致组装效率下降约90％(图2)。因此，DNA聚合酶是基于T5核酸外切酶组装方法中不可去除的关键成分。