[发明专利]一种毛囊干细胞的原代分离方法

说明书

本发明涉及一种毛囊干细胞的原代分离方法，清洗头皮组织，达到灭菌和去除皮下脂肪；去取出单个毛囊；去除真皮鞘；于0.25%胰蛋白酶中37℃消化10‑20分钟，待细胞完全解离后，终止消化，清洗；放置在培养皿中，切碎，分散在培养皿中，周围滴加50‑100ul DMEM/F12完全培养基，润湿切碎的毛囊，使之贴壁，然后放入37℃、含5%CO₂的培养箱中，倒置培养2小时；沿着培养皿壁缓慢添加5‑10ml DMEM/F12完全培养基，完全没过碎毛囊；前三天完全不动，第四天开始每3天隔着培养箱的玻璃观察是否需要添加培养基。成功分离毛囊干细胞，提高分离的效率，并对传代的毛囊干细胞的增殖能力无影响。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种毛囊干细胞的原代分离方法。

背景技术

皮肤是身体上最大的器官，覆盖着身体表面，并与外界接触。它是由角化分层表皮和富含胶原蛋白的皮肤结缔组织组成的，其中包括来自表皮的毛囊、皮脂腺、汗腺和指甲等附属器官。皮肤及其附属物为动物的生存提供了至关重要的保护性屏障。毛囊是皮肤的重要附属器官，具有独特的结构和周期性生长的能力，在哺乳动物的整个生命周期具有再生的特征，而毛囊干细胞（Hair follicle stem cell, HFSC）是维持毛囊组织自我更新的基础。

干细胞是一类具有自我更新能力和分化能力的原始细胞，在细胞的生长和分化过程中期主要作用。毛囊的周期性生长提示着毛囊结构中也存在着干细胞，即毛囊干细胞。它和其他成体干细胞一样，其超微结构及生化特征方面都具有未分化细胞的一些共有特征。HFSC最显著的特征是慢周期性和自我更新能力，下行迁移则分化可分化为毛囊和毛干的各种上皮类群细胞，向上迁移则分化成皮脂腺和表皮细胞。

现有研究表明，HFSC位于皮脂腺下部的外根鞘，立毛肌与毛囊根鞘相交汇的地方，通常称为隆突部。皮肤中的毛囊深入到真皮和真皮下，其自身处于不断自我更新的循环周期中，但是只有毛囊根鞘的隆突部是一个稳定存在的部位 ，被认为是干细胞存在的部位，是毛囊更新的细胞来源。

毛囊相对其他诸如胎盘、脐带等组织而言非常小，采用组织块贴壁法，难以辨识隆突部位；采用酶消化法又因具体的组织状况不同而难以统一酶的作用时间，因此毛囊干细胞的分离较困难。

发明内容

为解决成功分离毛囊干细胞，并对传代的毛囊干细胞的增殖能力无影响的问题，本发明目的在于：一种毛囊干细胞的原代分离方法。

本发明目的通过如下方案实现：一种毛囊干细胞的原代分离方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤1、清洗头皮组织，达到灭菌和去除皮下脂肪，采用生理盐水或含双抗的PBS反复清洗从志愿者手术后得到头皮，去除多余的皮下脂肪组织；

步骤2、解剖镜下用灭菌的镊子从脂肪端拉出毛囊，得到单个毛囊；

步骤3、将单个毛囊加入到0.25%中性蛋白酶，37℃消化13-30分钟，去除真皮鞘；

步骤4、将去除真皮鞘的毛囊于0.25%胰蛋白酶中37℃消化10-20分钟，待细胞完全解离后，用含10%FBS和双抗的DMEM/F12完全培养基终止消化，然后用含双抗的PBS清洗两次；

步骤5、将清洗完的毛囊放置在直径10cm的培养皿中，用灭菌的手术刀或者手术剪切碎，分散在培养皿中，周围滴加50-100ul DMEM/F12完全培养基，润湿切碎的毛囊，使之贴壁，然后放入37℃、含5% CO₂的培养箱中，倒置培养2小时；

步骤6、2小时后，沿着培养皿壁缓慢添加5-10ml DMEM/F12完全培养基，完全没过碎毛囊；

步骤7、前三天完全不动，第四天开始每3天隔着培养箱的玻璃观察是否需要添加培养基。

进一步的，步骤1为：将得到的头皮采用75%的乙醇浸泡1-3分钟，以灭杀可能存在的细菌、真菌，避免对之后的培养造成干扰；然后再采用生理盐水或含双抗的PBS反复清洗，去除多余的皮下脂肪。