[发明专利]一种高灵敏检测PBMC中他克莫司浓度的方法

说明书

本发明涉及生物医学领域，特别是涉及高灵敏检测PBMC中他克莫司浓度的方法。所述方法包括：提取待测全血样品PBMC的裂解产物，然后对待测PBMC裂解产物进行前处理，最后对前处理的产物进行纳升液相串联高分辨质谱法检测。前处理包括对已去除红细胞并裂解的PBMC产物，加入已知浓度的他克莫司同位素内标工作液和复配沉淀剂(甲醇+二氯甲烷)进行沉淀处理，获取上清液，中加入复配萃取剂(二氯甲烷+超纯水)进行萃取处理，获取下层溶液，对下层溶液挥干处理，向挥干产物加入复溶剂进行复溶处理，得到复溶产物，取复溶产物进行纳升液相串联高分辨质谱法检测。本发明通过提高检测灵敏度，降低检测定量限，仅需0.8‑1.2mL全血样本即可检测PBMC中他克莫司浓度，减小采血对移植患者的创伤。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，特别是涉及高灵敏检测PBMC中他克莫司浓度的方法。

背景技术

他克莫司(Tacrolimus，TAC，又名FK506)在移植术后的维持治疗方案中使用率最高，用于预防移植术后的移植物排斥反应。由于其代谢个体差异性大、药物相互作用较复杂且治疗窗较窄，需要对其血药浓度进行监测。他克莫司在血液中的分布比较复杂，吸收入血后约85-95％进入红细胞，仅0.5％进入淋巴细胞发挥药理作用。血浆中他克莫司含量较低，游离的仅占0.3-2％，与白蛋白、α-酸性糖蛋白(AGP)结合的他克莫司约占血浆他克莫司总量的60％，另外分别有30％、8％、1％结合于高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)。

由于他克莫司在血液中的分布较复杂，目前临床主要是监测全血中他克莫司的谷浓度。在血细胞、血浆蛋白等指标正常的情况下，他克莫司全血谷浓度能够反映其真实起效和不良反应相关浓度。然而，在器官移植状态下，患者可能会发生下述情况：1、贫血：贫血后红细胞数量减少，导致血浆中他克莫司浓度增加；2、低白蛋白血症：肝衰竭后蛋白合成减少、肾衰竭后蛋白损失增多；3、低脂蛋白血症：在移植围术期，脂蛋白浓度可能会因合成减少、代谢增加而降低50％，导致血浆中游离他克莫司浓度增加；4、术后继发的感染以及糖皮质激素、大环内酯类抗生素、他克莫司等药物的使用可能导致AGP的浓度升高，继而降低血浆中游离他克莫司的浓度。

上述移植术后患者可能发生的情况均会影响他克莫司在血浆和各种血细胞中的分布，使其在血液中的分布变得更加复杂。然而，他克莫司发挥药效是通过进入淋巴细胞与FKBP12结合，抑制免疫因子的表达，进而实现免疫抑制的作用。因此，移植患者淋巴细胞中的他克莫司浓度才能够真实反映其药效浓度。外周血单个核细胞(PBMC)以淋巴细胞为主，可通过检测PBMC中他克莫司浓度评估他克莫司在淋巴细胞中的浓度。

但是PBMC中他克莫司浓度较低，常规方法检测其浓度较困难。目前超高效液相串联质谱技术(UPLC-MS/MS)检测PBMC中他克莫司浓度的检测定量限最低仅能够达到0.1ng/mL，因此需要至少采集患者3-4mL抗凝全血。由于移植术后患者血液检测项目较多，所有项目检测下来需要的采血量也较多，对患者造成的损伤越大。因此，为了减小对患者的损伤，减少检测的全血用量十分重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高灵敏检测PBMC中他克莫司浓度的方法，在现有技术基础上，大幅提高检测灵敏度，减少检测所需全血用量，减小对患者的损伤。

本发明的方法包括：

一种高灵敏检测PBMC中他克莫司浓度的方法，其包括：

S1、提取待测全血样品PBMC裂解产物，步骤如下：

S11、将2.5-3.5mL的PBMC分离液加入离心管中，再加入0.8-1.2mL全血样本，放入离心机中离心，获得离心产物后吸取中间白膜层细胞转移至新离心管中进行清洗，清洗方法为：加入PBMC清洗液，轻柔混匀，离心机离心；按前述方法清洗2-3次，获离心产物；