[发明专利]一种高灵敏检测PBMC中他克莫司浓度的方法

权利要求书

1.一种高灵敏检测PBMC中他克莫司浓度的方法，其特征在于，包括：

S1、提取待测全血样品PBMC裂解产物，步骤如下：

S11、将2.5-3.5mL的PBMC分离液加入离心管中，再加入0.8-1.2mL全血样本，放入离心机中离心，离心条件为350-450g离心30-40min，获得离心产物后吸取中间白膜层细胞转移至新离心管中进行清洗，清洗方法为：加入PBMC清洗液，轻柔混匀，离心机离心，离心的条件为350-450g离心8-10min；按前述方法清洗2-3次，获离心产物；所述轻柔混匀的方式为采用移液枪或一次性滴管吹吸8-10次；

S12、向离心产物加入红细胞裂解液，室温静置5-10min以裂解未完全分离的红细胞，转移至新离心管中进行离心处理，离心的条件为350-450g离心8-10min，获离心产物后，再次加入PBMC清洗液进行清洗，获得离心产物；S11-S12中，清洗使用的PBMC清洗液为0.85-0.95%氯化钠溶液，加入体积为4-6mL；

S13、对离心产物进行细胞裂解处理，获取上清液，即为待测全血样品PBMC裂解产物；对细胞裂解处理的条件为：4℃垂直混悬仪轻柔混匀8-10min后，再4℃下3000rpm离心5-10min，离心后获取上清液；

S2、对待测全血样品PBMC进行前处理，步骤如下：

S21、取待测全血样品PBMC裂解产物，加入已知浓度和体积的他克莫司同位素内标工作液和复配沉淀剂进行沉淀处理，获取上清液；

其中，待测全血样品PBMC裂解产物、复配沉淀剂、他克莫司同位素内标工作液的体积比为80：710-750:20；其中他克莫司同位素内标工作液之后的他克莫司同位素内标浓度为200-300pg/mL，复配沉淀剂中甲醇与二氯甲烷的体积比为470~490:240~260；沉淀处理的条件为涡旋混匀3-5min后4℃下12000rpm离心5-10min；

S22、向上清液中加入复配萃取剂进行萃取处理，获取下层溶液，对下层溶液进行挥干处理，向挥干产物中加入复溶剂进行复溶处理，得到复溶产物；

其中，复配沉淀剂为甲醇和二氯甲烷，复配萃取剂为二氯甲烷和超纯水；复溶剂为甲酸+乙腈的超纯水溶液；

其中，复配萃取剂中二氯甲烷加入量240-260μL，超纯水体积为360-380μL，萃取处理的条件为涡旋混匀1-3min后4℃下12000rpm离心5-10min，挥干处理的条件为38-42℃真空离心20-30min或者室温氮气吹干；复溶剂由甲酸、乙腈和超纯水按体积比1:490:510混合而成，加入体积为50-100μL；复溶处理的条件为涡旋混匀1-3min后4℃下12000rpm离心5-10min；

S3、取复溶产物，采用纳升液相串联高分辨质谱法检测；

纳升液相条件为：流动相A由超纯水和甲酸按体积比1000:1混合而成，流动相B由甲醇、超纯水和甲酸按体积比980:20:1混合而成，柱温为18-24℃，样品池温度为8℃，进样体积为10μL，捕获色谱柱和分离色谱柱为纳米C18色谱柱；

梯度洗脱流程如下：

0-5min，由50%流动相A和50%流动相B逐渐转变为100%流动相B洗脱，流速为300nL/分钟；

5-10min,以100%流动相B洗脱，流速为300nL/分钟；

10-15min,由100%流动相B逐渐转变为50%流动相A和50%流动相B洗脱，流速为300nL/分钟；

高分辨质谱参数设置为：扫描模式为Full scan结合PRM模式，正离子模式，Full scan模式分辨率为70000，AGC target为3×e⁶，最大注射时间为200ms，扫描范围为821-825m/z；PRM模式分辨率为70000，AGC target为3×e⁶，最大注射时间为240ms，isolation window为1.0m/z，NCE为15，Inclusion Mass为他克莫司821.51580m/z、他克莫司同位素内标824.53170m/z；

纳升液相串联高分辨质谱法读取结果时，二级色谱图的提取离子为他克莫司768.46922m/z、他克莫司同位素内标771.48512m/z，Mass Tolerance为5ppm。