[发明专利]一种注射用水包油型乳剂黏膜疫苗及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种注射用水包油型乳剂黏膜疫苗及其制备方法和应用，属于生物制药领域。所述注射用水包油型乳剂黏膜疫苗包括：初乳、全反式维甲酸、金属离子化合物、抗原。所述全反式维甲酸可以溶解在制备初乳的油相中，也可以分散在含pH缓冲液的初乳中，金属离子化合物吸附于初乳表面，抗原在制备的过程中加入并通过金属离子化合物吸附于初乳表面，实现抗原和疏水性全反式维甲酸的共同包载。本发明提供的水包油型乳剂黏膜疫苗，通过注射免疫的方式，与已有方法的单一激活相比，能同时实现体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫的多重保护，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种注射用水包油型乳剂黏膜疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

黏膜免疫系统，包括肠黏膜相关淋巴组织、支气管黏膜相关淋巴组织、泌尿生殖道黏膜相关淋巴组织、肺黏膜相关淋巴组织和眼结膜相关淋巴组织。黏膜表面与外界有害病原体直接接触，是机体抵抗沙门氏菌、口蹄疫病毒、幽门螺杆菌、流感病毒等感染的第一道防线。疫苗接种是防控感染疾病的最有效方式。因此，如果在诱导体液免疫和细胞免疫的同时，激活黏膜免疫，能大大提高疫苗的防控效力，从而降低防治工作的人力成本。

分泌型免疫球蛋白(SIgA)是黏膜免疫中的主要抗体，充当着黏膜的第一道防线，在黏膜免疫中起到关键作用。SIgA主要分布在唾液、泪液、肠胃液、乳汁、生殖道分泌液及呼吸道分泌液中。

疫苗的免疫途径极大地影响了其引起的免疫类型。传统的疫苗接种方式如皮下注射、肌肉注射和皮内注射由于组织限制性已被反复证明无法实现黏膜免疫的激活。引发黏膜免疫应答最有效的方式就是经黏膜途径给药。然而，高浓度可溶性抗原在黏膜表面刺激容易诱导免疫耐受。除此之外，极端的pH、丰富的蛋白酶、上皮屏障和黏膜屏障等导致黏膜给药所诱导的免疫应答往往差强人意。目前为止，应用最广的上市黏膜疫苗为脊髓灰质炎口服疫苗和轮状病毒口服疫苗。但这两种疫苗均为减毒活疫苗，存在诸多问题，例如毒力返祖的潜在危险，且其不稳定，不易于保存和运输，同时也不合适免疫缺陷及免疫功能低下人群接种。

相比之下，亚单位疫苗、多肽疫苗和DNA疫苗具有纯度高、安全性好、可规模化生产等优势，从而得到广泛的开发。但是由于这些疫苗的免疫原性普遍较弱，因此常添加佐剂以增强其诱导免疫反应的能力。另外，利用疫苗递送载体，如脂质体、纳米粒等，能够显著改善疫苗的稳定性并提高免疫应答水平。然而，这些疫苗都通过注射的方式接种，不能引发有效的黏膜免疫应答，无法实现抗原特异性SIgA的分泌。因此，亟需开发一种注射用的黏膜疫苗，以期实现体液免疫应答、细胞免疫应答和黏膜免疫应答的多重保护。

全反式维甲酸(RA)别名维A酸，维甲酸等，是维生素A的一种重要活性代谢物，在体内由维生素A通过一系列的复杂过程转化而来。研究发现肠道中的派式结树突状细胞、肠系膜淋巴结树突状细胞和固有层树突状细胞能将维生素A代谢为全反式维甲酸。全反式维甲酸不仅调控固有免疫反应中的巨噬细胞、树突状细胞和固有淋巴样细胞，而且也调控获得性免疫应发中的T细胞和B细胞的功能。此外，全反式维甲酸也能诱导黏膜归巢受体在B细胞的表达，并将B细胞转换成产生IgA的浆细胞，促进SIgA的分泌，参与黏膜免疫应答。

由于全反式维甲酸是一种难溶于水的小分子，因此一般需要使用PEG400或植物油等溶剂进行溶解，但是高剂量且频繁的给药次数对其应用带来了极大的不便，适应性差。而本发明通过将RA包载于纳米粒中解决了上述问题，实现了诱导黏膜免疫应答的效果。本发明设计一种能同时高效包载抗原和疏水性全反式维甲酸的疫苗载体，实现了全反式维甲酸与抗原的共递送，诱导了更强的免疫应答，且通过常规的注射免疫方式，同时实现了体液免疫应答、细胞免疫应答和黏膜免疫应答的有效激活，具有重要的应用价值。

全反式维甲酸是诱导黏膜免疫的关键分子，其引起的免疫应答强度与RA的剂量有关，低剂量RA往往不能诱导有效的免疫应答。因此，为了提高RA的载药量，本发明通过将其溶解在制备初乳的油相中以及通过旋转蒸发法得到含RA的薄膜再分散于上述初乳中，大大提高了RA的载药量。