[发明专利]一种表达可溶性猫ω干扰素的基因工程菌合成方法、构建方法及应用

说明书

本发明公开一种表达可溶性猫ω干扰素的基因工程菌合成方法、构建方法及应用，查找编码猫ω干扰素成熟蛋白的基因序列利用软件预测此基因可能含有一段信号肽序列，为其氨基酸序列的前23个氨基酸，利用软件检测此序列功能，发现其为帮助蛋白分泌的信号肽而非蛋白结构所必需，因此去掉信号肽序列，剩下编码成熟猫ω干扰素的基因序列，其核苷酸长度为543bp；将编码猫ω干扰素的密码子与大肠杆菌偏好性密码子进行比对，根据密码子的兼并性，在不改变氨基酸组成和排列的基础上，对已知的编码猫ω干扰素的基因序列进行改造，替换为大肠杆菌偏好的密码子。本发明所制备的基因工程菌的阴性对照孔的细胞未产生任何病变，因此干扰素本身对细胞没有毒害作用。

技术领域

本发明涉及宠物用药技术领域，具体涉及一种表达可溶性猫ω干扰素的基因工程菌合成方法、构建方法及应用。

背景技术

随着我国经济的迅速发展和人民生活水平的不断提高，我国宠物行业也得到了飞速地发展。目前我国宠物犬、猫的数量约有1亿只，且数量仍在急剧增长，而围绕宠物发生的消费也在急剧增加，展示着巨大的市场前景。但是，同时我们也清楚地看到，越来越多越来越复杂的犬、猫疾病，特别是各种病毒性疾病，严重地危害着它们的健康，同时也威胁到人类健康。农业部第560公告废止了包括金刚烷胺、金刚乙胺、阿昔洛韦、吗啉(双)胍(病毒灵)、利巴韦林等抗病毒化药的使用，使得广大兽医和养殖人员急需一种无残留、安全的抗病毒药，而干扰素作为一种安全生物制品填补了市场的空白。干扰素具有的生物学活性及其速效多能的特点使其在抑制病毒增殖，抑制肿瘤生长，免疫调节等方面具有重要意义。

本项目旨在构建高效表达重组猫干扰素工程菌，制备有效的猫干扰素生物制剂，对防治猫科疾病，尤其是各种病毒性疾病具有重要的指导意义。

一般情况下，动物体内相关细胞的干扰素基因处于静止状态，只有在病毒等因素的诱导下才能表达，且表达量极微，难以直接提取纯化。因此，应用干扰素防治病毒性疾病时，必须考虑研制和开发高效生产干扰素的途径。而利用基因工程技术研制和开发重组干扰素是一条高效而经济的途径，生产具有廉价、广谱抗病毒活性、无毒害、无残留等优点的干扰素是促使干扰素在兽医临床上推广应用的有效途径。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种表达可溶性猫ω干扰素的基因工程菌合成方法、构建方法及应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种表达可溶性猫ω干扰素的基因工程菌合成方法，其创新点在于，具体步骤如下：

S1、登录GenBank，查找编码猫ω干扰素成熟蛋白的基因序列；

S2、将编码猫ω干扰素的密码子与大肠杆菌偏好密码子进行比对，根据密码子的兼并性。将猫ω干扰素密码子替换为大肠杆菌偏好的密码子；

S3、将替换后的基因序列5’、3’端分别加上NdeI、XhoI酶切位点，进行全基因合成，并连接入原核表达质粒pET28a中，得到重组原核表达质粒pET28a-FeIFN-ω，通过热激转化法转入Rosetta-gami2(DE3)感受态细胞，经鉴定获得阳性重组菌株后通过发酵条件优化，即可获得高表达可溶性蛋白的基因工程菌。

一种表达可溶性猫ω干扰素的基因工程菌构建方法，其创新点在于，具体步骤如下：

S1、将Rosetta-gami 2(DE3)菌株感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入重组载体pet28a-FeIFN-ω10μL并用手拨打EP管底轻轻混匀且避免用枪吸打，冰中静置25分钟；

S2、将42℃水浴热激90秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率；

S3、向离心管中加入1mL不含抗生素的无菌培养基(LB)，混匀后37℃，200rpm复苏60分钟；