[发明专利]一种表达可溶性猫ω干扰素的基因工程菌合成方法、构建方法及应用

权利要求书

1.一种表达可溶性猫ω干扰素的基因工程菌合成方法，其特征在于，具体步骤如下：

S1、登录GenBank，查找编码猫ω干扰素成熟蛋白的基因序列；

S2、将编码猫ω干扰素的密码子与大肠杆菌偏好密码子进行比对，根据密码子的兼并性，将猫ω干扰素密码子替换为大肠杆菌偏好的密码子；

S3、将替换后的基因序列5’、3’端分别加上NdeI、XhoI酶切位点，进行全基因合成，并连接入原核表达质粒pET28a中，得到重组原核表达质粒pET28a-FeIFN-ω，通过热激转化法转入Rosetta-gami2(DE3)感受态细胞，经鉴定获得表达重组猫ω干扰素的阳性菌株后，通过发酵条件优化获得高表达可溶性蛋白的基因工程菌。

2.一种根据权利要求1所述的表达可溶性猫ω干扰素的基因工程菌构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

S1、将Rosetta-gami 2(DE3)菌株感受态细胞从-80℃冰柜拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入10μL重组载体pet28a-FeIFN-ω并用手拨打EP管底轻轻混匀且避免用枪吸打，冰中静置25分钟；

S2、用42℃水浴热激90秒，迅速放回冰上并静置2分钟，避免晃动；

S3、向离心管中加入1mL不含抗生素的无菌培养基(LB)，混匀后置于37℃摇床，200rpm复苏60分钟；

S4、再采用5000rpm离心1分钟收菌，留取100μL左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含50μg/mL卡那霉素的LB培养基上(LB培养基：胰蛋白胨1％；酵母粉0.5％；氯化钠1％)；

S5、将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养；

S6、随机挑取10个LB平板上的菌株分别接入含卡那的LB培养液1mL中，37℃，200rpm培养8h后，进行PCR鉴定。

3.一种根据权利要求1或2所述的表达可溶性猫ω干扰素的基因工程菌应用，其特征在于，具体为诱导表达，包括以下步骤：

S1、取0.5mL带有重组质粒的菌液加入100mL的LB培养液(含终浓度为50μμg/mL的卡那霉素)中，置于37℃摇床，以150r/min的转速，过夜培养活化；以8％的接种量将菌液接种至200mL的LB培养液(含终浓度为50μg/mL的卡那霉素)中，置22℃摇床，以200r/min的转速培养，当菌液OD₆₀₀值约为0.4时，每100mL菌液中加入200μl浓度为100mM的IPTG诱导表达，在22℃，200r/min的条件下过夜诱导目的蛋白的表达(16h)；

S2、超声波破碎方法处理样品：取100mL菌液，以8000r/min的转速离心5min，去上清，沉淀用10mL 1×PBS洗涤2次，8000r/min，离心5min，留沉淀，加入10mL 1×PBS混匀后，进行超声波破碎(工作2s，间隙2s，工作总时长10min)，将细胞破碎液进行离心10000r/min，离心10min；

S3、取上清再离心1次，将上清液用0.45微米滤器过滤除杂质后，取上清液40μL加入10μL 5×SDS上样缓冲液，沸水浴10min，待检测；

S4、取待测样品15μL进行SDS-PAGE电泳检测，发现高表达的可溶性猫ω干扰素蛋白；

S5、按照蛋白纯化仪的操作说明进行操作，采用Chelating

Sepharose^TMFast Flow亲和层析预装柱进行蛋白纯化，纯化的干扰素样品进行SDS-PAGE电泳并用Western Blot检测纯化结果，用Bradford法检测蛋白浓度。