[发明专利]一种低免疫原性鱼皮胶原蛋白及其制备方法

说明书

本发明提供了一种低免疫原性鱼皮胶原及其制备方法。所述制备方法以鱼皮为原料，经过鱼皮预处理、除杂脱脂、胶原蛋白的粗提及端肽的去除、胶原蛋白的精制及干燥、内毒素灭活等方式得到杂蛋白、脂肪、端肽、内毒素含量明显降低的胶原蛋白。本发明在鱼皮预处理阶段利用过氧化氢、氢氧化钠处理，在一定时间点换液可使鱼皮预处理效果更佳；在提取及进一步脱除免疫原阶段利用乙酸和蛋白酶进行酶切端肽处理，精制冻干得到胶原蛋白成品后通过辐照灭活内毒素。本发明提取方法简单，提取效率较高，得到的胶原蛋白免疫原物质含量低、纯度较高，有效降低胶原蛋白在医用过程中的不良反应，进一步扩大胶原蛋白的应用领域。

技术领域

本发明属于胶原蛋白提取技术领域，具体涉及一种低免疫原性鱼皮胶原蛋白及其制备方法。

背景技术

胶原蛋白是动物体内含量极其丰富的结构蛋白，是一种天然功能性生物大分子。原胶原分子是组成胶原蛋白的基本结构单位，由三条左手螺旋的α-肽链组成，三条α-肽链再通过相互作用缠绕成胶原蛋白的右手超螺旋结构。胶原蛋白具有(Gly-X-Y)n的三肽重复序列，其中X、Y常为脯氨酸（Pro）和羟脯氨酸（Hyp）。甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸共同作用，对氢键的形成和维持胶原三螺旋结构具有重要意义。

近年来中国渔业的快速发展，鱼类资源加工过程中产生的副产物增多，从鱼皮中提取胶原蛋白引起了研究者们的广泛关注。鱼皮中胶原蛋白含量丰富，从鱼皮中提取胶原可以提高资源利用率，具有重要的经济意义。另外，从鱼皮中提取的胶原蛋白在低过敏性、吸水性等特性都优于陆生胶原蛋白，具有较好的应用价值。

胶原蛋白因其良好的生物特性，在医疗领域具有广泛的应用。但胶原蛋白中存在的会引发免疫原性的物质如杂蛋白、脂肪、端肽、内毒素等，会使人体产生不良的免疫反应，限制了胶原基生物材料的进一步应用。因此，如何制备出低免疫原性的胶原蛋白成为一个亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种低免疫原性鱼皮胶原蛋白及其制备方法。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种低免疫原性鱼皮胶原蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

（1）鱼皮前处理：将巴沙鱼皮去除残肉和结缔组织，剪成小块，用纯水清洗、沥干；

（2）鱼皮中杂蛋白、脂肪及部分内毒素的脱除：向沥干的巴沙鱼皮加入过氧化氢-氢氧化钠溶液处理2~6h，巴沙鱼皮与过氧化氢-氢氧化钠溶液的料液比w/v为1:20-1:30；用氯化钠溶液洗净过氧化氢后，加入氢氧化钠溶液搅拌处理3~5h后，用纯水将巴沙鱼皮洗至中性；

（3）鱼皮胶原蛋白的粗提及端肽的去除：向步骤（2）中获得的巴沙鱼皮中加入乙酸溶液和酸性蛋白酶搅拌48~72h，巴沙鱼皮与乙酸溶液的料液比w/v为1:40~1:60；离心取上清液，得到去端肽的胶原蛋白粗提液；

（4）胶原蛋白的精制及干燥：将氯化钠粉末加入到胶原蛋白粗提液中进行盐析，离心得到胶原蛋白沉淀；将所述胶原蛋白沉淀复溶于乙酸溶液，用弱碱溶液透析至透析外液pH≥8灭酶后，先后用乙酸溶液和超纯水透析，得到精制的胶原蛋白溶液，冷冻干燥后得到冻干的胶原蛋白；

（5）内毒素灭活：将步骤（4）中冻干的胶原蛋白进行辐照处理，灭活细菌及内毒素；获得所述低免疫原性鱼皮胶原蛋白。

本发明中所述w/v中的w单位为g，v的单位为mL。

进一步的，所述制备方法的所有步骤在2~8℃下进行，纯水、过氧化氢-氢氧化钠溶液、氢氧化钠溶液、氯化钠溶液、乙酸溶液、弱碱溶液均在2~8℃预冷。

进一步的，所述步骤（2）中过氧化氢-氢氧化钠溶液中过氧化氢的质量浓度为1%~3%，氢氧化钠的摩尔浓度为0.1~0.2M。

进一步的，所述步骤（2）中氯化钠溶液的质量浓度为0.7~1.0%。