[发明专利]基于聚集诱导发射标记的核酸适配体和叠氮官能化单壁碳纳米管对甲胎蛋白的检测方法

说明书

本发明属于生物化学、环境检测和食品安全技术领域，具体涉及蛋白检测方法，更具体为基于叠氮功能化的单壁碳纳米管SWNTs与荧光标记的适配体在无铜(I)催化的条件下发生click反应，荧光被淬灭。加入甲胎蛋白AFP后，DNA优先与该蛋白发生特异性结合，导致适体构象发生变化，荧光有所恢复。此外，本发明所使用末端修饰有辛炔苯环DBCO的核酸适配体，该核酸适配体能够与AFP发生特异性结合诱导构象发生改变，提高AFP的检测灵敏度。

技术领域

本发明属于生物化学、环境检测和食品安全技术领域，涉及蛋白检测方法，尤其是基于聚集诱导发射标记的核酸适配体和叠氮官能化单壁碳纳米管对甲胎蛋白的检测方法。

背景技术

甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是一种肝癌常用的蛋白质生物学标志物，能够比较准确地诊断相关癌症。AFP通常由7-8月胎儿卵黄囊产生，从肝脏分泌出来的一种分子量约为70kDa的血浆蛋白，随着胎儿的出生以及生长，其含量逐渐下降。在健康人的血清中，AFP浓度低于25ng/mL几乎检测不到，但据统计在将近75％的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者中，AFP水平明显升高至500ng/mL。成人血液中高含量的AFP可能表明存在某些类型的癌症，特别是HCC、胃癌、胰腺癌、卵巢癌或睾丸癌，因此在临床上成人血清中AFP浓度升高被广泛认为是HCC或皮内窦瘤的早期指征。聚集诱导发射(aggregation-induced emission，AIE)是一类发光分子，在稀溶液中呈非发射性状态，但当该分子处于聚集态时，便能使发射得到很大程度的增强。基于该特性特性，AIE能够作为适体生物传感器的荧光指示剂，为传感平台产生更高灵敏度和准确性的“开启”荧光信号。纳米材料和生物分子的结合在生物传感器领域发挥着越来越重要的作用，碳纳米管(carbon nanotubes,CNTs)作一种新型的纳米材料因其具有独特的光电性能和机械性能而得到广泛研究及应用。此外，有关研究表明因SWNT能够在荧光适体传感器中充当FRET的能量受体，因此常作为优良的淬灭剂用于构建纳米生物传感器。

点击化学是一种以碳-杂原子键(C-X-C)合成为基础的组合化学新方法，并借助这些反应来简单高效地获得分子多样性，其代表反应为铜催化的叠氮-炔基Husigen环加成反应。然而，由于铜(I)作为金属催化剂所产生的毒性往往会导致部分核苷酸发生降解以及蛋白质的变性甚至对活细胞或有机体等方面的实践应用产生一定程度的限制，但CuAAC反应所包含的缺陷都可用无铜变体的反应来克服，即“无铜点击化学”。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明利用环辛炔试剂与叠氮化物的反应速率比较接近于金属催化的速率，故此利用DBCO修饰的核酸适配体与SWNTs的叠氮官能化进行无铜的点击化学，再充分利用AIE的FRET和SWNTs的优异性能，减少假阳性信号的出现，从而对AFP进行检测。

基于聚集诱导发射标记的核酸适配体和叠氮官能化单壁碳纳米管对甲胎蛋白检测的方法，包括如下步骤：

(1)在DNA序列末端修饰辛炔苯环DBCO，将修饰后的DNA序列溶于超纯水中；

(2)SWNTs-N₃缀合物的制备：

先使用超声清洗机将SWNTs分散均匀配制成溶液，在初始SWNTs溶液中，加入 NaOH和氯乙酸后，水浴超声处理，待SWNTs表面的-OH转化为-COOH，冲洗、离心、纯化，干燥，得到羧基官能化的SWNTs，即SWCNTs-COOH；

将得到的SWCNTs-COOH溶解于甲醇溶液中进行超声，将SWNTs-COOH和 N₃-PEG-NH₂加入到HEPES缓冲溶液中并充分混合，室温下反应，通过-COOH和-NH₂的共价结合形成叠氮官能化单壁碳纳米管SWNTs-N₃；

(3)荧光获取：将TPETA溶液和步骤(1)中修饰后的DNA加入到含有PBS的棕色离心管中，形成了具有荧光的DNA序列；