[发明专利]基于聚集诱导发射标记的核酸适配体和叠氮官能化单壁碳纳米管对甲胎蛋白的检测方法

权利要求书

1.基于聚集诱导发射标记的核酸适配体和叠氮官能化单壁碳纳米管对甲胎蛋白的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)在DNA序列末端修饰辛炔苯环DBCO，将修饰后的DNA序列溶于超纯水中；

(2)SWNTs-N₃缀合物的制备：

先使用超声清洗机将SWNTs分散均匀配制成溶液，在初始SWNTs溶液中，加入NaOH和氯乙酸后，水浴超声处理，待SWNTs表面的-OH转化为-COOH，冲洗、离心、纯化，干燥，得到羧基官能化的SWNTs，即SWCNTs-COOH；

将得到的SWCNTs-COOH溶解于甲醇溶液中进行超声，将SWNTs-COOH和N₃-PEG-NH₂加入到HEPES缓冲溶液中并充分混合，室温下反应，通过-COOH和-NH₂的共价结合形成叠氮官能化单壁碳纳米管SWNTs-N₃；

(3)荧光获取：将TPETA溶液和步骤(1)中修饰后的DNA加入到含有PBS的棕色离心管中，形成了具有荧光的DNA序列；

(4)淬灭：将步骤(3)的具有荧光的DNA序列在室温下温育后，加入步骤(2)制得的SWNTs-N₃，反应过夜，SWNTs-N₃与DNA末端修饰的DBCO官能团发生click反应，通过FRET作用，荧光被淬灭；

(5)AFP与其核酸适配体线性关系的获得：

在步骤(4)获得的溶液中加入一系列已知浓度的AFP溶液，常温下反应，反应结束后，测定荧光值，根据测定的荧光值和AFP制作出相应的线性关系图；

(6)AFP检测：

在步骤(4)获得的溶液中，加入一定量未知浓度的AFP，常温下反应，反应结束后，测量其荧光回复值，再根据步骤(5)得到的线性关系，得出AFP的浓度。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述DNA的序列为：DNA：5'-DBCO-GTG ACG CTC CTA ACG CTG ACT CAG GTG CAG TTC TCG ACT CGG TCT TGA TGT GGGTCC TGT CCG TCC GAA CCA ATC-3'。修饰后的DNA序列溶于超纯水后终浓度为50nM。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，

初始SWNTs溶液的浓度为2mg/mL；

初始SWNTs溶液、NaOH和氯乙酸的用量比例为5mL：0.6g：0.5g；

甲醇溶液的体积百分浓度为10％；

SWNTs-COOH甲醇溶液中，SWNTs-COOH的浓度为2mg/mL；

SWNTs-COOH溶液、N₃-PEG-NH₂和HEPES缓冲溶液的用量比为5mL：100mg：10mL，其中，HEPES缓冲溶液的浓度为0.1M，pH 7.4。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中，室温下反应时间为12h。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述具有荧光的DNA序列中，TPETA终浓度为10μM，DNA终浓度为30nM。

6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)中，温育时间为15min，SWNTs-N3的终浓度为20μg/mL；反应温度为4℃。

7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(5)中，AFP溶液的浓度为0.1～80ng/mL，常温下反应的时间为30分钟；步骤(4)获得的溶液和AFP溶液的体积比为300μL：1.5～3μL。

8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(6)中，常温下反应的时间为30分钟。