[发明专利]高效人多能干细胞体外诱导分化为多谱系小肠类器官方法

说明书

本发明提供了一种高效人多能干细胞体外诱导分化为多谱系小肠类器官方法，该方法包括如下步骤：S1、诱导人多能干细胞分化形成内胚层样细胞；首先在含有GDF 8、CHIR99021和B27的第一诱导培养基中培养，再用含有GDF 8和B27的第二诱导培养基培养，然后再更换为含有激活素A和dFBS的第三诱导培养基继续培养得到；S2、诱导内胚层样细胞分化为中‑后肠球；S3、诱导中‑后肠球分化为小肠类器官。该方法相比于目前广泛流行几种方法，可大幅提高小肠类器官产生效率，节约成本。

技术领域

本发明涉及干细胞生物学及再生医学领域，尤其是涉及一种高效人多能干细胞体外诱导分化为多谱系小肠类器官方法。

背景技术

小肠在营养吸收、病原屏障、药物转运与代谢等方面发挥重要作用。在口服药研发的临床前研究阶段，需使用人小肠组织或细胞对吸收、转运、代谢等药代动力学指标进行精准预测。然而，供体的不足致使这些原代资源难以获取；而目前被广泛使用的人结肠癌细胞Caco-2存在药物转运蛋白与正常组织表达差异过大、药物代谢酶表达量低等问题。

随着近年再生医学与组织工程学的迅猛发展，由人多能干细胞（humanpluripotent stem cells，hPSC）于体外诱导分化为3D小肠类器官的技术为解决这一难题带来了希望：一方面，相比于单层的Caco-2细胞，3D类器官包含更生理相关的结构与谱系，更贴近体内；另一方面，由于hPSC的自我更新能力，可源源不断地进行类器官分化用以供给。

目前，自hPSC向小肠类器官诱导分化的方法，均沿用或改良于Jason R. Spence等人最初创立的分化系统（Directed differentiation of human pluripotent stem cellsinto intestinal tissue in vitro[J]. Nature, 2011, 470(7332): 105-109.）。然而，此系统分化效率低、成本高、难以实现大范围的应用（A refined culture system forhuman induced pluripotent stem cell-derived intestinal epithelial organoids[J]. Stem cell reports, 2018, 10(1): 314-328..）。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种高效人多能干细胞体外诱导分化为多谱系小肠类器官方法，相比于目前广泛流行几种方法Generation of small intestinal organoidsfor experimental intestinal physiology.Methods in Cell Biology 159 (2020):143-174.; Differentiation of human intestinal organoids with endogenousvascular endothelial cells. Developmental Cell, 54(4), 516-528; Generation ofintestinal organoids derived from human pluripotent stem cells for drugtesting. Scientific reports, 2020, 10(1): 1-11.），可大幅提高小肠类器官产生效率，节约成本。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种高效人多能干细胞体外诱导分化为多谱系小肠类器官方法，该方法包括如下步骤：

S1、诱导人多能干细胞分化形成内胚层样细胞；

首先在含有GDF 8、CHIR99021和B27的第一诱导培养基中培养，再用含有GDF 8和B27的第二诱导培养基培养，然后再更换为含有激活素A和dFBS的第三诱导培养基继续培养得到；

S2、诱导内胚层样细胞分化为中-后肠球；