[发明专利]高效人多能干细胞体外诱导分化为多谱系小肠类器官方法有效
| 申请号： | 202110940521.5 | 申请日： | 2021-08-17 |
| 公开（公告）号： | CN113388572B | 公开（公告）日： | 2021-11-19 |
| 发明（设计）人： | 葛啸虎;吴迪;曹宁;徐迎;田应洲 | 申请（专利权）人： | 天九再生医学（天津）科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/071 | 分类号： | C12N5/071 |
| 代理公司： | 天津合正知识产权代理有限公司 12229 | 代理人： | 马云云 |
| 地址： | 300301 天津市滨海新区滨海高新*** | 国省代码： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 高效 多能 干细胞 体外 诱导 化为 谱系 小肠 器官 方法 | ||
1.一种高效人多能干细胞体外诱导分化为多谱系小肠类器官方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
S1、诱导人多能干细胞分化形成内胚层样细胞；
首先在含有GDF 8、CHIR99021和B27的第一诱导培养基中培养，再用含有GDF 8和B27的第二诱导培养基培养，然后再更换为含有激活素A和dFBS的第三诱导培养基继续培养得到；
S2、诱导内胚层样细胞分化为中-后肠球；
S3、诱导中-后肠球分化为小肠类器官；
其中，B27为B27- insulin；
在第一诱导培养基中的培养时间为24h，在第二诱导培养基中的培养时间为24h，在第三诱导培养基中的培养时间为24h；
所述第一诱导培养基含有RPMI-1640培养基作为基础培养基，并添加100ng/mlrhGDF8、1-5μM CHIR99021、0.5-2% B27- insulin、0.2-1% GlutaMAX和0.5-2% NEAA；
所述第二诱导培养基含有RPMI-1640培养基作为基础培养基，并添加100ng/mlrhGDF8、0.5-2% B27- insulin、0.2-1% GlutaMAX和0.5-2% NEAA ；
所述第三诱导培养基含有RPMI-1640培养基作为基础培养基，并添加50-300ng/mlrhActA、0.5-2% dFBS、0.2-1% GlutaMAX和0.5-2% NEAA 。
2.根据权利要求1所述的高效人多能干细胞体外诱导分化为多谱系小肠类器官方法，其特征在于：所述S2包括如下步骤：
将S1步骤中得到的内胚层样细胞在第四诱导培养基中培养4-8天，其中，第四诱导培养基含有RPMI-1640培养基作为基础培养基，并添加1-5μM CHIR99021、100-1000ng/ml FGF4、0.5-3% dFBS、0.2-1% GlutaMAX和0.5-2% NEAA。
3.根据权利要求2所述的高效人多能干细胞体外诱导分化为多谱系小肠类器官方法，其特征在于：所述S2培养条件为37℃、5% CO2，每24h更换新培养基。
4.根据权利要求1所述的高效人多能干细胞体外诱导分化为多谱系小肠类器官方法，其特征在于：所述S3包括如下步骤：
收集中-后肠球，加入肠分化培养基中，并继续培养20-30天，其中，肠分化培养基含有Advanced DMEM/F12培养基作为基础培养基，并添加50-300ng/ml rhEGF、50-200ng/mlrhNOG、300-1000ng/ml rhRSPO、0.5-1% B27、0.5-1% N2、3-15mM HEPES、0.2-1% GlutaMAX和0.5-2% NEAA。
5.根据权利要求4所述的高效人多能干细胞体外诱导分化为多谱系小肠类器官方法，其特征在于：所述S3培养条件为37℃、5% CO2，每72h更换新培养基。
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