[发明专利]一种苦瓜外泌体、提取方法及在制备治疗烧烫伤皮肤药物中的应用

说明书

本发明公开一种苦瓜外泌体、提取方法及在制备治疗烧烫伤皮肤药物中的应用，提取步骤如下：S1、取新鲜云南山野苦瓜，摘除根茎，水洗，待水分干后，切开去籽，榨汁；S2、将榨出的苦瓜汁连续离心；离心后取上清，弃沉淀，将上清液继续进行超速离心，离心后弃上清，得沉淀悬液；S3、在离心管中依梯度加好蔗糖溶液，在最上层加入所得沉淀悬液，然后超速离心；S4、离心结束后分别收集分层置入清洗后的离心管中，加入冰PBS溶液后混合均匀，离心，用1‑3ml PBS溶液重悬沉淀后用滤膜过滤，取滤液分装。本发明的提取方法利用蔗糖梯度纯化，能够大大提高纯度和得率；提取的苦瓜外泌体能用于制备治疗烧烫伤皮肤药物，对皮肤深Ⅱ度烫伤有明显修复作用，修复后无疤痕。

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种苦瓜外泌体、提取方法及在制备治疗烧烫伤皮肤药物中的应用。

背景技术

烧烫伤是指因皮肤接触火焰、蒸气及高热金属而导致的热效应性损伤，也是人们生活和工作中最常见的意外伤害之一，烧烫伤引起的皮肤损伤，不仅会破坏皮肤的天然屏障作用，还会导致内环境紊乱、代谢失常等不良后果，危重症者全身多个脏器系统都有不同程度的损害，危及生命。烫伤创面的愈合及治疗过程比较复杂、时间较长，烫伤创面愈合后可留有疤痕挛缩和功能障碍等后遗症，是一种复杂和严重的外伤性疾病。因此，在烫伤早期早期阶段采取恰当的药物进行治疗对于伤口的愈合康复、避免感染等显得尤为重要。

根据烫伤后皮肤创面受损的范围和深度，可将烫伤分为Ⅰ度烫伤、浅Ⅱ度烫伤、深Ⅱ度烫伤、Ⅲ度烫伤四种类型。其中，深Ⅱ度烫伤模型是科研过程中最常建立、最常研究的模型。正常皮肤构造主要包含两大重要成分：表皮和真皮。表皮中有丰富的角质细胞，真皮较厚，富含维持皮肤机械强度的细胞外基质蛋白，如胶原I和弹性蛋白。深Ⅱ度烫伤皮肤的损伤包括整个表皮的损伤并伤及到乳头层以下真皮层，但仍残留有部分真皮。深Ⅱ度烫伤的创面修复是涉及多个生物学的、比较复杂的一系列过程，包括炎症反应期、肉芽组织形成期、组织重塑期这主要的三大时期。其愈合的过程依赖于残存上皮细胞的迁移和增殖，以及成纤维细胞、炎症细胞、细胞外基质成分的共同参与。

外泌体是指包含了复杂微小RNA（miRNA）和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。许多植物中发现含蛋白质和miRNA的外泌体样纳米粒子，这些植物外泌体由于缺乏毒性，有大规模生产的可能性，其内在特性具有携带药物或miRNA分子等其他化合物的可能性。植物外泌体的直径约40～150 nm，具有磷脂双分子层结构，呈茶托状或杯状，由大量脂质、包括mi RNA和蛋白质组成。植物外泌体含有较为丰富的miRNA，该RNA是高效的基因表达调控因子，其不仅在原始系统内执行生物学功能，还可进行跨界基因表达调控，在生物体中发挥重要的作用。研究表明，植物外泌体具有抗炎、抗病毒、抗纤维化、抗肿瘤等作用，还能参与病原体侵袭的防御反应。然而，目前还未见有利用植物外泌体，尤其是苦瓜外泌体来治疗、修复烫伤皮肤的报道。

发明内容

针对现有技术中的不足之处，本发明提供一种苦瓜外泌体、提取方法及在制备治疗烧烫伤皮肤药物中的应用。

为了达到上述目的，本发明技术方案如下：一种苦瓜外泌体的提取方法，包括以下步骤：

S1、取适量克数的新鲜云南山野苦瓜，摘除根茎，用自来水洗三遍后再用蒸馏水洗三遍，每遍约2-3min，待水分干后，切开去籽，榨汁；

S2、将榨出的苦瓜汁连续离心，于4℃，1000 g，10 min；3000 g，20 min；10000 g，40 min；离心后取上清，弃沉淀，将上清液继续进行超速离心，于超速冰冻离心机4℃，150000 g，离心90 min，离心后弃上清，得沉淀悬液；

S3、在离心管中依梯度加好蔗糖溶液，在最上层加入步骤S2所得沉淀悬液，然后于150000g下超速离心120min；