[发明专利]一种高效合成软骨素寡聚糖的重组谷氨酸棒杆菌

说明书

本发明公开了一种高效合成软骨素及其寡聚糖的重组谷氨酸棒杆菌，属于生物工程技术领域。本发明构建的重组谷氨酸棒杆菌生产的软骨素寡聚糖的产量达到20g Lsupgt;‑1/supgt;。通过构建软骨素合成途径并异源表达软骨素裂解酶，可以直接一步法发酵获得软骨素寡聚糖。本发明为微生物高效合成高纯度软骨素奠定了坚实的基础，构建的重组谷氨酸棒杆菌适合于工业化生产应用。

技术领域

本发明涉及一种高效合成软骨素寡聚糖的重组谷氨酸棒杆菌，属于生物工程技术领域。

背景技术

硫酸软骨素是由葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺为二糖单位聚合而成并经过一定程度修饰的直链酸性黏多糖。硫酸软骨素具有较好的粘弹性，保湿性和抑制炎性，还具有止痛、促进软骨再生等作用而被广泛应用于医药和保健品领域。高分子量软骨素具有良好的保湿、润滑的作用，可被用于医药领域。软骨素寡聚糖能够高效地被机体吸收，从而维护关节促进修复，而被用于口服保健品领域。

目前市场上的硫酸软骨素主要通过动物组织提取获得，但利用动物组织提取法提取硫酸软骨素存在许多缺点，首先组织提取法提取工艺复杂、步骤繁琐且最终获取产品纯度低，而产品的纯度直接影响产品的质量，低纯度的样品很难达到医药水平的要求。其次组织提取原材料为动物组织，存在原料来源限制问题且不同批次不同来源的组织，提取获得的样品分子量大小、修饰位点、修饰程度都存在差异，因此动物提取法获得的硫酸软骨素存在产品均一性问题。低分子量硫酸软骨素能够更好的被机体所吸收、利用，且功能更全面、高效。而组织提取获得的主要为高分子量的硫酸软骨素，获取寡聚糖还需要通过物理化学法和酶法等手段进一步处理才能获取，提高了产品制备的难度和成本。

为了解决上述的问题，人们希望利用基因工程技术在一些工程菌株中构建软骨素的合成途径获取软骨素，然后利用体外酶法催化获取专一、高纯度的硫酸软骨素。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是如何利用微生物一步合成软骨素寡糖。

[技术方案]

本发明在谷氨酸棒杆菌中引入软骨素的合成途径，并在此基础上引入软骨素裂解酶，从而获得能够一步法生产软骨素寡聚糖的重组菌株。

本发明提供一种用于合成软骨素寡糖的重组谷氨酸棒杆菌，该重组谷氨酸棒杆菌异源表达软骨素合酶，并异源表达能够降解软骨素分子的软骨素裂解酶，所述软骨素合酶为(a)、(b)或(c)所示：

(a)来源于大肠杆菌(Escherichia coli K4)的软骨素合酶KfoC(SEQ ID NO.1)，或与其有60％以上同源性的软骨素合酶；

(b)来源于多杀巴斯德杆菌(P.multocida)pmCS(SEQ ID NO.2)，或与其有60％以上同源性的酶；

(c)含有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的酶；

(d)在(a)或(b)中经过取代或缺失且具有软骨素合酶活性的由(a)或(b)衍生的蛋白质。

在一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌还重组表达N-乙酰葡萄糖胺差向异构酶，催化UDP-葡萄糖胺合成UDP-半乳糖胺，从而促进软骨素合成。所述葡萄糖胺差向异构酶来源于大肠杆菌(E.coli K4)，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。