[发明专利]一种高效合成软骨素寡聚糖的重组谷氨酸棒杆菌

权利要求书

1.一种用于合成软骨素寡聚糖的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，异源表达软骨素合酶从而构建软骨素的合成途径，异源表达N-乙酰葡萄糖胺差向异构酶和强化前体物质UDP-N-乙酰半乳糖胺和/或UDP-葡萄糖醛酸的合成途径的酶的表达以促进软骨素的合成，并表达软骨素裂解酶用于将软骨素裂解为软骨素寡聚糖；所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032；

所述软骨素合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述N-乙酰葡萄糖胺差向异构酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述软骨素裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述强化前体物质UDP-N-乙酰半乳糖胺和/或UDP-葡萄糖醛酸的合成途径的酶为谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶、磷酸葡萄糖变位酶、UDP-N-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶/葡萄糖-1-磷酸乙酰转移酶双功能酶、磷酸葡萄糖变构酶、葡萄糖-6-磷酸尿酰胺转移酶和UDP-葡萄糖脱氢酶；

所述谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶的NCBI reference sequence为WP_012514860.1，所述磷酸葡萄糖变构酶GlmM的NCBI reference sequence为WP_012677779.1，所述UDP-N-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶/葡萄糖-1-磷酸乙酰转移酶双功能酶GlmU的NCBI reference sequence为WP_012677301.1，所述UDP-葡萄糖脱氢酶UgdA的NCBIreference sequence为WP_012677300.1，所述谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶GlmS的NCBI reference sequence为WP_012514860.1。

2.根据权利要求1所述的一种用于合成软骨素寡聚糖的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述的软骨素裂解酶N端融合了麦芽糖促融标签，且软骨素裂解酶N端前5个氨基酸序列进行了截短突变。

3.根据权利要求1或2所述的一种用于合成软骨素寡聚糖的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，将编码软骨素合酶、编码前体物质UDP-N-乙酰葡萄糖胺和UDP-葡萄糖醛酸合成途径的基因及编码软骨素裂解酶的基因与载体连接或者整合至谷氨酸棒杆菌基因组上进行表达。

4.根据权利要求3所述的一种用于合成软骨素寡聚糖的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，所述载体包括以下任一种：pXMJ19、pECXK99E、pEC-XT99A、pEKEx1、pEKEx2、pVWEx1、pVWEx2、pZ8-1、pECTAC-K99、pAPE12；基因组整合位点包括基因组上任何非必需基因位点。

5.一种生产软骨素寡聚糖的方法，其特征在于，应用权利要求1~4任一所述的重组谷氨酸棒杆菌进行发酵培养；所述发酵培养指的是在含有碳源、氮源、无机盐、金属离子和氧气的环境中，于10~45℃的条件下进行发酵培养，培养周期在8-240 h之间；在发酵过程补料流加碳源、氮源、无机盐、金属离子等营养物质。

6.权利要求1~4任一所述重组谷氨酸棒杆菌在制备软骨素及其衍生产品方面的应用。