[发明专利]一种用于检测鉴定狄克氏属细菌的引物对、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种用于检测鉴定狄克氏属细菌的引物对、试剂盒及方法。所述引物对包括正向引物和反向引物，正向引物为DicCSP‑F1或DicCSP‑F2，反向引物为DicCSP‑R1或DicCSP‑R2，其中，DicCSP‑F2和DicCSP‑R2为简并引物。使用本发明引物对进行PCR，能且只能从含有Dickeya属细菌基因组DNA的样品中扩增出123～124bp的基因片段，用于鉴定和检疫Dickeya属细菌。此引物对也适用于荧光定量PCR，检测灵敏度比常规PCR高100倍，能准确灵敏地检验检疫Dickeya属细菌。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于检测鉴定狄克氏属细菌的引物对、试剂盒及方法。

背景技术

肠杆菌目(Enterobacteriales)果胶杆菌科(Pectobacteriaceae)细菌通过产生果胶酶，降解植物细胞壁中的果胶，破坏植物细胞，导致植物细胞死亡和组织软化，发生植物软腐病，为害众多蔬菜和粮食作物、观赏花卉和林木。其中Dickeya属细菌寄主范围广泛，包括10个目的11种双子叶植物和5个目的10种单子叶植物，如马铃薯、甘薯、水稻和玉米等。

目前，Dickeya属已被鉴定了12个种，其中绝大多数种的菌株是植物病原菌。如D.dadantii能够引起甘薯茎腐病；D.zeae可以危害水稻、香蕉、芭蕉芋等重要作物；D.dianthicola已被发现在马铃薯、番茄、菊苣、洋蓟以及观赏性植物如秋海棠、大丽花、小苍兰、风信子、鸢尾花、长寿花和马蹄莲属中引起病害。此外，Dickeya属不同种的菌株能侵染同一种植物产生相似的病症，如D.solani，D.dianthicola，D.dadantii，D.chrysanthemi和D.zeae等种的细菌都能侵染马铃薯并导致软腐病害。因为Dickeya属多数细菌是检疫性有害生物，检疫时没必要区分不同种，所以适合用属水平的通用引物来检测鉴定Dickeya属的病原菌。

目前，国内外用聚合酶链式反应(PCR)检测鉴定Dickeya属细菌所用的引物有针对Dickeya属16S～23S间隔区设计的引物对Df/Dr(Laurila等，European Journal of PlantPathology，2010，126：249-262)，针对Dickeya属细菌特有标志基因的引物Dda1F/Dda1R(Kabir等，Microorganisms，2020，358)，以及基于细菌全基因组序列设计高通量PCR引物的流程设计的Dickeya属细菌的通用引物DIC-D(Pritchard等，Plant Pathology，2013，62：587-596)。但是，这些引物对或不具有Dickeya属特异性或不具有Dickeya属通用性。如用引物对Df/Dr，只能检测Dickeya属的部分细菌，得到假阴性结果。用引物对Dda1F/Dda1R不仅能扩增出Dickeya属细菌，还能扩增出部分Pectobacterium属细菌；引物DIC-D不仅能扩增出Dickeya属细菌，还能扩增出Pectobacterium属、Brenneria属、Erwinia属和Pantoea属的细菌，得到假阳性结果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有PCR检测Dickeya属细菌引物特异性低或通用性低、检测易出现假阳性或假阴性的缺点，目的在于提供一种能够准确鉴定和检疫Dickeya属细菌的方法。

本发明的解决方案是，基于NCBI数据库中Pectobacteriaceae科细菌的全基因组序列，进行泛基因组分析找到Dickeya属的保守标志蛋白(conserved signatureproteins，CSPs)，以CSP基因序列为靶序列设计Dickeya属的特异引物，在NCBI数据库中BLAST评估引物对Dickeya属细菌的通用性和特异性。选择通用性和特异性强的引物，对Dickeya属和近缘属进行PCR检测，检验引物的通用性和特异性，确定Dickeya属特异的通用引物。