[发明专利]一种核酸适体筛选方法

说明书

本发明公开了一种核酸适体筛选方法，包括：将待检验的核酸样品分为两组，第一组核酸样品在不含靶物质的条件下进行扩增，或不进行扩增，第二组一组核酸样品在含有靶物质的条件下进行扩增；对扩增后的两组核酸样品分别进行测序；测序完成后，比较两组核酸样品中核酸序列的覆盖深度差异，找出第二组中覆盖深度明显下降的核酸序列，筛选出候选核酸适体。该筛选方法能够更加简便、快捷、大批量地进行核酸适体的筛选，适用于从较长序列的核酸、多物种的基因组中筛选候选核酸适体。

技术领域

本发明涉及生物技术，特别涉及一种核酸适体筛选方法。

背景技术

核酸适体一般是指分子大小介于25～60个核苷酸的单链寡核苷酸序列，它通过折叠成稳定的三维结构与靶标分子产生特异性分子间相互作用，能特异结合蛋白质或其他小分子物质。核酸适体具有与抗体相当或更优异的特异性和亲和力，且兼具靶标范围广、生产成本低、易规模化制备、可实现精准化学合成和修饰以及免疫原性低等优势。

目前使用较为广泛的核酸适体筛选方式是通过指数富集的配体系统进化技术(Systematic Evolution ofLigands by Exponential Enrichment，SELEX)，从随机单链核酸序列库中筛选出特异性与靶物质高度亲和的核酸适体。SELEX技术的基本思想是在体外通过化学方法合成一个单链寡核苷酸库，用其与靶物质混合，靶物质将与对应的核酸适体结合形成复合物，洗去与靶物质不结合或与靶物质有高亲和力外的核酸分子，通过一轮又一轮重复的筛选与扩增，文库中核酸适体的纯度逐渐增大，从而能够分离纯化出与靶物质高度亲和的核酸适体。

根据发现，一些核酸适体会在靶物质的作用下会产生构象上的变化，例如形成四联体或茎环等二级结构。例如铅离子的某些核酸适体能够形成G四联体，这是一种富含鸟嘌呤的DNA或RNA链折叠形成的稳定的核酸二级结构。在铅离子的作用下，具有特定序列的核酸片段作为核酸适体与其结合，形成非常稳定的G四联体结构；此外还有其他某些特定序列的核酸片段能够与铅离子作用形成稳定的茎环结构。能够和核酸适体结合形成核酸二级结构的靶物质包括汞离子、铅离子等金属离子，一些无机离子，以及抗生素、黄酮类化合物、PDS、凝血酶等有机物。如果对产生二级结构的核酸片段进行扩增，该结构会阻止DNA聚合酶或逆转录酶前进，使扩增难度变大，得到的扩增片段减少。片段数量的减少会体现在下一步测序的结果中，从而筛选出对应靶物质的核酸适体。

SELEX筛选方式的库容量大，适应范围广，能够获得高亲和力的核酸配体，但是需要进行多轮重复的筛选与扩增，并且非特异性扩增是一个难以避免的重要问题。此外在分离与靶物质结合的寡核苷酸的环节中，由于DNA的疏水性质，会导致部分非结合游离核酸残留在滤膜上，产生背景吸附。如果背景吸附率过高，会导致筛选轮数增多，甚至是筛选失败。而基于测序技术通过比对覆盖深度的核酸适体筛选方式将扩增和筛选过程进行了简化，仅仅通过一次扩增和一轮测序就能够大批量得获得候选的核酸适体，使筛选过程更加简便高效。

现有技术中还未见基于测序的候选核酸适体筛选方法。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供一种高效、简便的核酸适体筛选方法。

技术方案：本发明提供一种核酸适体筛选方法，包括如下步骤：

(1)将待检验的核酸样品分为两组，第一组核酸样品在不含靶物质的条件下进行扩增，或不进行扩增，第二组核酸样品在含有靶物质的条件下进行扩增；

(2)对扩增后的两组核酸样品分别进行测序；

(3)测序完成后，比较两组核酸样品中核酸序列的覆盖深度差异，找出第二组中覆盖深度明显下降的核酸序列，筛选出候选核酸适体。

进一步地，所述步骤(1)中待检验的核酸样品为真核生物、原核生物或病毒的天然DNA或RNA或来自于人工合成的核酸序列。