[发明专利]一种重组小鼠成熟PRTN3蛋白的纯化方法

说明书

本发明公开了一种重组小鼠成熟PRTN3蛋白的纯化方法，首先构建mPRTN3‑pET‑20b(+)质粒，再在mPRTN3‑pET‑20b(+)质粒的mPRTN3成熟肽段氨基端加入甲硫氨酸‑谷氨酸辅助性序列，在羧基端加入His‑tag标签，重新构建得到pro‑mPRTN3‑pET‑20b(+)重组质粒，然后向含有上述重组质粒的菌液中添加诱导剂诱导重组成熟pro‑mPRTN3蛋白表达，对重组成熟pro‑mPRTN3蛋白过镍柱纯化后，去除其中的辅助性序列，得到重组成熟mPRTN3蛋白，然后对重组成熟mPRTN3蛋白进行纯化。本发明得到的重组成熟mPRTN3蛋白，具有纯度高、活性好的特点。

技术领域

本发明属于生物工程基因领域，涉及一种重组小鼠成熟PRTN3蛋白的纯化方法。

背景技术

PRTN3(Proteinase 3)是由中性粒细胞分泌的主要丝氨酸蛋白酶之一，其生物学功能广泛，可通过水解多种组织蛋白，调控免疫反应参与相关疾病的进展。PRTN3能够对细胞因子进行加工，如裂解CXCL8的前体从而活化CXCL8、趋化中性粒细胞迁移到炎症部位、加重组织损伤、参与慢性阻塞性肺疾病等。PRTN3还可加工细胞受体调控信号传导，从而在炎症反应中发挥一定的作用，如PRTN3可以裂解蛋白酶激活受体1(PAR-1)致其失活，来解除凝血酶激活的钙信号，从而破坏内皮细胞屏障的完整性。此外，PRTN3还可以直接或间接地调控炎症反应，例如水解NF-κB和p21导致其失活，加速内皮细胞凋亡，参与血管炎、克罗恩病等疾病。

小鼠PRTN3(mPRTN3)由254个氨基酸组成，其中第1-27个氨基酸是信号肽，第28-29个氨基酸和第251-254个氨基酸是前导肽。PRTN3首先以没有活性的酶原形式合成，在翻译的过程中，初级结构中的信号肽被信号肽酶水解，然后在内质网加工时前导肽被剪切，最终形成其成熟形式，小鼠PRTN3的氨基酸结构示意图如图1所示。

目前关于成熟PRTN3蛋白纯化的研究很少。O.Wiesner等通过构建外源过表达初始mPRTN3的HMC-1细胞，从中纯化得到初始mPRTN3蛋白。而小鼠成熟PRTN3(成熟mPRTN3)蛋白是其发挥功能的主要形式，因此为了深入研究成熟mPRTN3蛋白在疾病中的作用，开发一种成熟mPRTN3蛋白纯化的方法势在必行。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种重组小鼠成熟PRTN3蛋白的纯化方法。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种重组小鼠成熟PRTN3蛋白的纯化方法，包括以下步骤：

S1：利用pET-20b(+)载体构建含有编码小鼠PRTN3成熟肽段序列的质粒，记为mPRTN3-pET-20b(+)；

S2：在步骤S1得到的mPRTN3-pET-20b(+)质粒的基础上构建pro-mPRTN3-pET-20b(+)重组质粒，得到包含pro-mPRTN3-pET-20b(+)重组质粒的菌液；

所述pro-mPRTN3为在mPRTN3-pET-20b(+)质粒的mPRTN3成熟肽段氨基端加入甲硫氨酸-谷氨酸辅助性序列，在羧基端加入His-tag标签得到的前体mPRTN3；

S3：培养步骤S2得到的包含pro-mPRTN3-pET-20b(+)重组质粒的菌液，然后向菌液中加入诱导剂进行蛋白诱导表达，得到包含重组成熟pro-mPRTN3蛋白的菌液；

S4：对S3得到的重组成熟pro-mPRTN3蛋白进行纯化，得到包含纯化后重组成熟pro-mPRTN3蛋白的Ni-NTA琼脂糖凝胶；

S5：去除S4步骤中的重组成熟pro-mPRTN3蛋白的辅助性序列，得到重组成熟mPRTN3蛋白，然后对重组mPRTN3蛋白进行纯化。

进一步地，所述S1包括以下步骤：