[发明专利]一种重组小鼠成熟PRTN3蛋白的纯化方法

权利要求书

1.一种重组小鼠成熟PRTN3蛋白的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：利用pET-20b(+)载体构建含有编码小鼠PRTN3成熟肽段序列的质粒，记为mPRTN3-pET-20b(+)；

S2：在步骤S1得到的mPRTN3-pET-20b(+)质粒的基础上构建pro-mPRTN3-pET-20b(+)重组质粒，得到包含pro-mPRTN3-pET-20b(+)重组质粒的菌液；

所述pro-mPRTN3为在mPRTN3-pET-20b(+)质粒的mPRTN3成熟肽段氨基端加入甲硫氨酸-谷氨酸辅助性序列，在羧基端加入His-tag标签得到的前体mPRTN3；

S3：培养步骤S2得到的包含pro-mPRTN3-pET-20b(+)重组质粒的菌液，然后向菌液中加入诱导剂进行蛋白诱导表达，得到包含重组成熟pro-mPRTN3蛋白的菌液；

S4：对S3得到的重组成熟pro-mPRTN3蛋白进行纯化，得到包含纯化后重组成熟pro-mPRTN3蛋白的Ni-NTA琼脂糖凝胶；

S5：去除S4步骤中的重组成熟pro-mPRTN3蛋白的辅助性序列，得到重组成熟mPRTN3蛋白，然后对重组mPRTN3蛋白进行纯化。

2.如权利要求1所述的重组小鼠成熟PRTN3蛋白的纯化方法，其特征在于，所述S1包括以下步骤：

(1)分别设计编码mPRTN3成熟肽段和pET-20b(+)载体的引物序列，PCR扩增得到目的mPRTN3序列和带有互补序列的pET-20b(+)载体；

(2)将步骤(1)PCR扩增的产物进行酶切过程；

(3)将步骤(2)的酶切产物进行转化、挑取单克隆菌落、摇菌，然后从菌液中提取质粒，得到含有编码小鼠PRTN3成熟肽段序列的mPRTN3-pET-20b(+)质粒。

3.如权利要求2所述的重组小鼠成熟PRTN3蛋白的纯化方法，其特征在于，所述编码小鼠PRTN3成熟肽段序列的前引物序列为GAAGGAGATATACATATGATTGTAGGTGGGCACGAGGCTC，后引物序列为TGGTGGTGGTGCTCGAGCCGCAGCACGTTTTGAATCCAG；

pET-20b(+)载体的前引物序列为TCGTGCCCACCTACAATCATATGTATATCTCCTTCTTAAAG，后引物序列为TTCAAAACGTCCTGCGGCTCGAGCACCACCACCACCACCAC。

4.如权利要求1所述的重组小鼠成熟PRTN3蛋白的纯化方法，其特征在于，所述S2包括以下步骤：

(1)通过设计引物、PCR扩增、酶切，将mPRTN3-pET-20b(+)质粒中的mPRTN3成熟肽段氨基端加入甲硫氨酸-谷氨酸辅助性序列，在羧基端加6个His-tag标签，得到前体mPRTN3，记为pro-mPRTN3；

(2)将步骤(1)的酶切产物进行转化、挑取单克隆菌落、摇菌，得到包含pro-mPRTN3-pET-20b(+)重组质粒的菌液。

5.如权利要求4所述的重组小鼠成熟PRTN3蛋白的纯化方法，其特征在于，所述谷氨酸序列的前引物序列为GGAGATATACATATGGAGATTGTAGGTGGGCACGAGGCTC，后引物序列为GTGCCCACCTACAATCTCCATATGTATATCTCCTTCTTAAAG。

6.如权利要求1所述的重组小鼠成熟PRTN3蛋白的纯化方法，其特征在于，所述S3包括以下步骤：

(1)培养步骤S2得到的包含pro-mPRTN3-pET-20b(+)重组质粒的菌液，至菌液的OD值达0.4-0.6；

(2)向步骤(1)的菌液中加入异丙基硫代半乳糖苷，过夜诱导，得到包含重组成熟pro-mPRTN3蛋白的菌液。

7.如权利要求1所述的重组小鼠成熟PRTN3蛋白的纯化方法，其特征在于，所述S4为采用蛋白质镍柱纯化的方式对S3得到的重组成熟pro-mPRTN3蛋白进行纯化，得到包含纯化后的重组成熟pro-mPRTN3蛋白的Ni-NTA琼脂糖凝胶。