[发明专利]检测黄瓜小西葫芦黄化花叶病毒病抗病基因zym的KASP引物及其应用

说明书

本发明涉及分子生物学和黄瓜育种技术领域，特别是指检测黄瓜小西葫芦黄化花叶病毒病抗病基因zym的KASP引物及其应用。本发明提供了可用于检测zym基因第86bp和第99bp不同基因型的KASP引物和包含KASP引物的试剂盒。本发明中的KASP引物或试剂盒可用于鉴定黄瓜中是否含有ZYMV抗病基因zym，区分含有zym基因的抗ZYMV的黄瓜和含有突变的Zym基因的感ZYMV的黄瓜。本发明相比现有技术可在黄瓜苗期快速、准确、高通量的进行ZYMV抗性鉴定，大大降低了苗期人工接种和田间抗性鉴定的工作量，其应用可提高黄瓜育种效率、加快育种进程，节约成本。所述的KASP引物及试剂盒可应用于黄瓜种质资源、各类亲本、杂交种等材料的鉴定。

技术领域

本发明涉及分子生物学和作物育种技术领域，特别是指检测黄瓜小西葫芦黄化花叶病毒病抗病基因zym的KASP引物及其应用。

背景技术

黄瓜(Cucumis sativus L.)属葫芦科一年生攀援状草本植物，原产印度，是国际上第三大蔬菜作物，也是我国主要栽培蔬菜之一。黄瓜小西葫芦黄化花叶病毒(ZucchiniYellow Mosaic Virus，ZYMV)是危害黄瓜的主要病毒之一，近年来在日光温室中广泛传播，严重影响了黄瓜产量和品质，培育抗病毒品种可以有效抵御ZYMV，减少损失。

ZYMV为马铃薯Y病毒属，主要通过蚜虫传播，可侵染葫芦科、苋科、藜科、豆科等多种植物。黄瓜感染ZYMV后，植株出现叶片黄化、花叶，并伴随泡状或瘤状突起，发病严重时植株矮化，叶片皱缩和果实发育畸形，甚至死亡。然而在实际生产中并无有效的化学药剂或其他方法能明显防治ZYMV的发生与传播。培育抗病毒的黄瓜新品种是防治ZYMV的根本途径。

常规育种费时费力，环境要求较高，难度较大，具有一定的局限性。近年来随着现代分子生物技术的发展，为植物育种提供了新的思维，加快育种进程。分子标记辅助选择是对目标性状在DNA水平上的选择，具有不受环境影响，不受等位基因显隐性关系干扰，选择结果准确可靠等优点，越来越被育种家青睐。常用的分子标记类型有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、CAPS等，并广泛应用于黄瓜育种中，但是这些标记操作繁琐、实验要求高、检测效率低，不适用大样品、高通量的检测。为满足育种需要，建立一种高效、便捷、准确地检测方法尤为重要。

SNP标记作为第3代分子标记，目前被公认是极具应用前景的分子标记技术，基于SNP标记开发的竞争性等位基因特异PCR(Kompetitive Allele Specific PCR，KASP)技术具有高通量、省时、便捷等优点，其特点是基于引物末端碱基的特异匹配对SNP分型，可在广泛的基因组DNA样品中对SNP位点进行精准的双等位基因判断，具有高度稳定性与准确性，成为SNP基因分型的主流。其主要特征是引物采用3条特异性引物，其中上游引物2条，3’端为等位基因变异碱基，5’端添加通用荧光接头序列，通用的下游引物为普通引物，常规PCR扩增，终点法荧光信号检测。

国内外学者对于ZYMV已经进行了很多研究，1973年Lisa等首次从西葫芦中分离并描述了ZYMV。Provvidenti等对ZYMV的遗传规律的研究，认为ZYMV抗性基因是受一对隐性基因zym/zym控制。Amano等将ZYMV的抗性基因zym^A192-18定位在黄瓜六号染色体50kb的区间内，通过对抗病与感病亲本间的基因序列分析，表明Vacuolar protein sorting-associated protein 4-like(VPS4-like)基因(Csa6G152960.1)最有可能是候选的ZYMV抗病基因，该基因可能与病毒的复制及在细胞间的移动有关。抗病与感病亲本在该基因的第一个外显子处存在两个SNP位点，分别位于第86bp(T/C)和第99bp(G/A)处。抗病亲本在第86bp为C，第99bp为A；感病亲本在第86bp为T，第99bp为G。这两处SNP位点使得利用KASP技术检测该基因成为可能，可以大幅提高抗病品种选育效率，缩短育种年限。

发明内容