[发明专利]一种利用秀丽隐杆线虫分泌的细胞外囊泡诱导寡孢节丛孢产生捕食器官的方法

说明书

本发明公开了一种利用线虫细胞外囊泡诱导捕食线虫真菌产生捕食器官的方法，包括如下步骤：(1)线虫的培养；(2)线虫细胞外囊泡的获得及线虫细胞外囊泡表征分析；(3)捕食线虫真菌寡孢节丛孢Arthrobotrys oligospora的培养；(4)利用线虫细胞外囊泡诱导寡孢节丛孢捕食器官的产生。本发明通过提取秀丽隐杆线虫的细胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs)，并利用获得的EVs成功诱导寡孢节丛孢产生捕食器官，说明线虫分泌的EVs中包含有诱导捕食线虫真菌产生捕食器官的物质。这对于理解线虫与捕食线虫真菌的互作机制具有重要的意义，同时在线虫生物防治领域具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及分子微生物学技术领域，具体涉及一种利用秀丽隐杆线虫分泌的细胞外囊泡诱导寡孢节丛孢产生捕食器官的方法。

背景技术

植物寄生线虫包括根结线虫、胞囊线虫和松材线虫等，在世界各地都有广泛分布。据统计，植物寄生线虫每年给全球的各种作物带来约1570亿美元的经济损失。在我国，此类线虫病害已成为农业生产中的第二大类病害，是农业生产中重要的限制因子之一。植物寄生线虫具有寄主多样化、容易传播、隐蔽、顽固、种群数量增长迅速等特点，加之土壤生态的特殊性，对其防治非常困难。长期以来，人们采用化学药物驱虫剂、轮作、引进抗性品种等措施来防治线虫危害，但每种方法各有利弊。使用化学药物驱虫剂虽然具有较好的杀虫效果，但是会给环境带来严重的污染，且很多化学药物是永久不能降解的；至于轮作，很多林木和经济作物是很难实施的；引进抗性品种在短时间内是一个有效防治线虫危害的方法，但是如果在同一地区连续种植某一抗性品种，随着时间的延长，原有的抗性品种就会逐渐丧失抗性，就不能防治线虫危害。而且，抗性基因的筛选及抗性品种的培育受农作物性状的限制，严重影响推广应用的速度。因此，采用线虫天敌进行生物防治已日益受到研究人员的关注（Siddiqui and Mahmood, 1996; 刘杏忠等, 2004）。

捕食线虫真菌（Nematode-trapping fungi）作为土壤生态系统中线虫的重要天敌，已经成为重要的生防真菌资源。这些真菌能够进化出复杂的捕食器官，如收缩环、非收缩环、粘性菌丝、粘性分枝、粘性网等来诱捕土壤中自由生活的线虫（张克勤等, 2006）。目前，食线虫真菌作为一种有效的生物防治资源已经广泛应用于植物寄生线虫的生物防治中，这些真菌开发的线虫生防制剂具有安全、无污染、无残留的优点。然而，由于人们对捕食线虫真菌与线虫互作的分子机制并不完全清楚，导致对线虫的生物防治防效不高、不稳等问题突出，从而限制了高效线虫生防制剂的研发和应用。寡孢节丛孢（ Arthiobotrys oligospora, Ao）作为捕食线虫真菌中研究最为深入的一种真菌，其在普通环境中营腐生生活，但在周围环境存在线虫时，该真菌则通过营养菌丝体特化形成三维菌网的捕器捕捉线虫。

捕食器官不仅是食线虫真菌用来攻击线虫的武器，也是它们从腐生生活方式转变为捕食生活方式的重要指标。研究该类真菌捕器的特征对于理解捕食线虫性真菌的作用机理具有重要意义。目前所正式报道的能诱导捕食线虫真菌产生捕食器官的诱导物质包括线虫提取液、尿素、氨基酸或多肽等。

近年来，一种由细胞主动分泌的具有膜结构的微小囊泡——细胞外囊泡(Extracellular vesicles，EVs) 成为生命科学研究的热点。EVs的直径在30~1000 nm之间，具有脂质双分子层结构，里面包裹着多种生物活性物质，主要包括蛋白质、核酸（DNA、mRNA、microRNA、lncRNA、circRNA等）、代谢物和脂质等。几乎所有细胞都能分泌EVs，它们可以通过内吞或膜融合的方式内化到受体细胞中，这些由EVs携载的生物活性物质在细胞间通信和机体调控中发挥着重要作用。

目前，尚未有利用秀丽隐杆线虫分泌的细胞外囊泡来诱导寡孢节丛孢产生捕食器官的报道。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中的问题，而提出的利用秀丽隐杆线虫分泌的细胞外囊泡诱导寡孢节丛孢产生捕食器官的方法。