[发明专利]一种利用秀丽隐杆线虫分泌的细胞外囊泡诱导寡孢节丛孢产生捕食器官的方法

权利要求书

1.一种利用秀丽隐杆线虫分泌的细胞外囊泡诱导寡孢节丛孢产生捕食器官的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）秀丽隐杆线虫的培养：

step1秀丽隐杆线虫的培养基和缓冲液：NGM固体培养基和S 完全培养基用于培养线虫；M9缓冲液用于清洗虫体及卵孵化；

Step2秀丽隐杆线虫的培养：将大肠杆菌OP50均匀涂布于NGM培养皿上后，接种线虫于20℃培养；在S 完全培养基中加入浓缩过的大肠杆菌OP50，摇床培养；

step3秀丽隐杆线虫同步化：当镜检发现线虫母体中含大量虫卵时，用M9缓冲液将线虫洗脱，自然沉淀，去除上清，加入线虫裂解液进行裂解，镜下观察线虫虫体完全消失时，加入M9缓冲液去除裂解液，用M9缓冲液重悬虫卵转移至35mm培养皿中，于20℃恒温培养18h后让虫体孵化；

（2）秀丽隐杆线虫细胞外囊泡的获得及表征分析：

用M9缓冲液清洗并重悬同步化的成虫，于20℃，180 rpm摇床培养12h后，冰上自然沉降，收集上清，将收集的上清梯度离心后用0.22μm滤头过滤，过滤完的上清超速离心后弃上清留沉淀，用PBS洗涤沉淀后再超速离心回收沉淀，随后用PBS重悬沉淀，所获沉淀即为线虫细胞外囊泡CEev；

使用透射电镜TEM观察囊泡形态；纳米颗粒跟踪分析NTA检测囊泡浓度和粒径；

（3）捕食线虫真菌寡孢节丛孢Arthrobotrys oligospora的培养：

PDA固体培养基用于培养寡孢节丛孢菌丝；CMY培养基用于培养寡孢节丛孢孢子；

（4）捕食线虫真菌捕食器官的诱导：

将寡孢节丛孢的孢子均匀涂布到WA培养基上，28°C恒温培养箱内倒置培养3-5天后，实验组：营养菌丝内加入线虫细胞外囊泡CEev，总蛋白浓度40-60mg；对照组：营养菌丝内加入等量PBS；空白组：营养菌丝加入等量无菌水；将培养皿静置于28°C恒温培养箱内孵育12-48h，光学显微镜下观察捕食器官三维菌网产生。

2.根据权利要求1所述的利用秀丽隐杆线虫分泌的细胞外囊泡诱导寡孢节丛孢产生捕食器官的方法，其特征在于：在步骤（1）的step1中，NGM固体培养基1L：称取细菌蛋白胨2.5g，氯化钠3g，琼脂粉20g，将除去琼脂粉的其余试剂溶于800mL去离子水中，待完全溶解后定容为1L，分装250mL到500mL锥形瓶中，每瓶按比例加入琼脂粉，121°C高压灭菌20分钟，待冷却至55℃左右时，加入过滤除菌的1mL 1M CaCl₂，1mL 1M MgSO₄，25mL 1M KPO₄ 缓冲液，1mL 浓度为5mg/mL的胆固醇，胆固醇溶于95%乙醇中，混匀后分装于平板中，吹干待用；

 500mL pH 6.0的1M浓度的 KPO₄缓冲液：54.15g KH₂PO₄，17.8g K₂HPO₄，去离子水定容至500mL，过滤除菌待用；

1L 的M9缓冲液：2.2mM KH₂PO₄，4.2 mM Na₂HPO₄，8.55 mM NaCl，去离子水定容至1L，121°C高压灭菌20分钟；

500mLS基础培养基：2.975g NaCl，0.5g K₂HPO₄，3g KH₂PO₄，0.5mL 5mg/mL溶于95%乙醇中的胆固醇，去离子水定容至500mL，121°C高压灭菌20分钟；

200mLpH 6.0的1M浓度的柠檬酸钾溶液：4g一水柠檬酸，58.7g柠檬酸三钾-水合物，去离子水定容至200mL，121°C高压灭菌20分钟；

1L pH 6.0的微量金属溶液：1.86g EDTA，0.69g FeSO₄·7H₂O，0.2g MnCl₂·4H₂O，0.29gZnSO₄·7H₂O，0.025g CuSO₄·5H₂O，去离子水定容至1L，121°C高压灭菌20分钟，4℃避光保存；

S完全培养基：在无菌条件下加入1L S基础培养基，10mL 1M柠檬酸钾溶液, 柠檬酸钾溶液的pH为6.0，10mL 微量金属溶液，3mL 1M CaCl₂，3mL 1M MgSO₄充分混匀。