[发明专利]固定化酶凝胶亲和吸附柱制备方法及从河鲀中提取活性肽的方法

权利要求书

1.从河鲀中提取活性肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S0：固定化酶凝胶亲和吸附柱的制备，

a：将ACE溶解于硼酸盐缓冲液制得ACE螯合配体溶液，ACE的酶活力单位为4.5-5.5U/ml；

b：往溴化氰活化琼脂糖凝胶4B中加入稀盐酸进行溶胀，溴化氰活化琼脂糖凝胶4B与稀盐酸的质量体积比为0.8-1.2g：5mL，过滤后用硼酸盐缓冲液清洗、滤干，除去残余HCl，得溴化氰活化琼脂糖4B填料；

c：将ACE螯合配体溶液与溴化氰活化琼脂糖4B填料混合，搅拌均匀后螯合过夜，螯合后，用4-6倍溴化氰活化琼脂糖4B填料体积的硼酸盐缓冲液进行清洗和过滤，除去多余的ACE；

d：将滤干后的溴化氰活化琼脂糖4B填料与Tris-HCl缓冲液混匀，进行轻柔振荡后过滤；

e：过滤后，采用醋酸盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液交替清洗过滤3-5次，得ACE固定化凝胶填料，将ACE固定化凝胶填料悬浮于硼酸盐缓冲液，装填入层析柱，即为固定化酶凝胶亲和吸附柱；

硼酸盐缓冲液的pH为8.1-8.4，摩尔浓度为0.08-0.12M，除步骤e的硼酸盐缓冲液外，其余步骤的硼酸盐缓冲液均含有0.45-0.55M的NaCl；

S1：肽组分的制备，取河鲀鲜鱼皮，绞碎后加入水，匀浆形成鱼皮浆料液，加入蛋白酶进行酶解，酶解后进行灭酶处理，冷却后调节pH值至中性，得酶解液，对酶解液进行微滤，然后进行超滤处理，获得分子量小于1kDa的肽组分；

S2：肽组分的亲和吸附和洗脱，将所述步骤S1获得的分子量小于1kDa的肽组分用所述步骤S0制得的固定化酶凝胶亲和吸附柱进行亲和吸附和洗脱，并进行紫外检测，紫外检测波长为220nm，收集洗脱峰组分，对洗脱峰组分进行脱盐，减压浓缩后待用；

S3：肽的序列鉴定，对步骤S2减压浓缩后的洗脱峰组分进行质谱测定，对质谱测定的结果进行分析，得到多条氨基酸序列；

S4：将多条肽按步骤S3测定的氨基酸序列进行固相合成，验证合成肽的ACE抑制活性，筛选得到ACE抑制活性高的活性肽。

2.根据权利要求1所述的从河鲀中提取活性肽的方法，其特征在于，

所述步骤S1中，采用酶活力单位为5万U/g的碱性蛋白酶进行酶解，酶解条件为碱性蛋白酶添加量为鱼皮浆料液质量的0.8-1.2%，pH值为7.8-8.2，酶解温度为58-62℃，酶解时间为5.8-6.2h。

3.根据权利要求1所述的从河鲀中提取活性肽的方法，其特征在于，

所述步骤S1中：

绞碎后加入的水为蒸馏水，河鲀鲜鱼皮与蒸馏水的质量体积比为0.9-1.1kg:10L；

采用转速为11000-13000rpm/min的组织匀浆器进行匀浆；

酶解后通过煮沸加热9-11min进行灭酶处理，采用HCl调节pH值至中性。

4.根据权利要求1所述的从河鲀中提取活性肽的方法，其特征在于，

所述步骤S1中，微滤采用Φ30mm×800mm的陶瓷膜元件，过滤精度为200nm，膜通量为600-1000L/M²H，超滤采用截留分子量为1kDa的聚醚砜超滤膜。