[发明专利]一种超声诱变的鼠伤寒沙门氏菌hisD基因InDel分子标记及应用

说明书

本发明提供了一种超声诱变的鼠伤寒沙门氏菌hisD基因InDel分子标记及应用，属于分子生物学和超声诱变技术领域；在本发明中，通过对鼠伤寒沙门氏菌进行超声诱变，测序发现所有InDel突变均发生在hisD基因一个核心突变区域，因此将该核心突变区域作为InDel分子标记，并将其用于分析基因回复突变插入或缺失的判定，同时该InDel分子标记也可以应用于分析hisD基因序列与其所编码蛋白质功能的关系。

技术领域

本发明属于分子生物学和超声诱变技术领域，具体涉及一种超声诱变的鼠伤寒沙门氏菌hisD基因InDel分子标记及应用。

背景技术

微生物在解决人类的粮食、能源、健康、资源和环境保护等问题中发挥着越来越重要且不可替代的独特作用，也为人类带来了巨大的社会效益和经济效益。为了获得高产、低耗、优质的菌种，人们常常通过物理、化学或生物因子等因素进行诱变育种。其中物理因素诱变由于安全性高、操作方便、设备简单和稳定性高等优点得到普遍关注。如通过紫外线辐射改变活性污泥的微生物组成结构，优化目标菌的生长环境，增强活性污泥的生化降解能力；通过离子注入诱变获得有益突变多且后代稳定遗传的突变体；通过飞秒激光技术，结合物理过程和生物化学反应过程，全面系统地研究诱变机理。其中超声场诱变因方向性好、穿透能力强、安全性高以及便于控制而受到越来越多的关注。

超声场诱变研究主要侧重于对生物效应的研究，而对其诱变机理的研究尚少，不利于超声诱变技术和超声设备的进一步发展。诱变机理的研究依赖于对基因变异的精准分析，超声等物理场带有高能效应会引起DNA链的变化，其变异主要分为三大类：1. 单核苷酸变异，（single nucleotide polymorphism，SNP）；2. 小的插入或缺失（Insertion andDeletion，InDel），指的是在基因组的某个位置上所发生的小片段序列的插入或者删除，其长度通常在50 bp以下；3. 大的结构性变异，这种类型比较多，包括长度在50 bp以上的长片段序列的插入或者删除、染色体倒位，染色体内部或染色体之间的序列易位，拷贝数变异，以及一些形式更为复杂的变异。第2和第3类变异通常也被称为基因组结构性变异（Structural variation，SV）。近年来研究人员发现SV对基因组的影响比起SNP来说还要大，基因组上的SV比起SNP而言，似乎更能用于解释物种群体多样性的特征，稀有且相同的一些结构性变异往往和疾病的发生相关联甚至还是其致病的诱因。

鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）是一种非适应性或泛嗜性的沙门氏菌，宿主范围广，是引起急性胃肠炎的主要病原菌之一，也是微生物遗传学发展的一种非常重要的细菌，常被改造为弱毒疫苗活载体，广泛应用于多种病毒、细菌、寄生虫等免疫研究，并取得了良好的效果。组氨酸营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）检测化学物质的潜在致癌性为观察基因突变的好方法，广泛地用于筛选化学物质或者物理场的遗传毒性和潜在致癌性。有资料报道Ames试验对大鼠致癌物和恒河猴致癌物的检出率分别为69.0%和87.5%，也是化合物QSAR构效关系建立的遗传毒性筛选数据库的重要基础。

参与组氨酸合成的基因主要有hisA、hisB、hisC、hisD、hisE、hisF、hisG、hisH和hisI等9个基因，这些基因的突变可能会引起组氨酸合成能力的丧失，而某些突变的基因可以通过回复突变恢复正常的基因功能，这是Ames试验的分子生物学基础。根据基因回复突变类型的不同，已发展出多种用于检测突变类型的菌株，其中对于点突变或者寡核苷酸链（≤ 4 bp）突变，发展出用于检测组氨酸靶基因中鸟嘌呤-胞嘧啶（G-C）位点碱基置换或移码突变的4种组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌（TA1535、TA1537/TA97/TA97a、TA98和TA100），以及用于检测组氨酸或色氨酸基因中腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T）位点碱基置换或移码突变的鼠伤寒沙门氏菌（TA102）；对于DNA大规模受损引起的易错修复突变，发展出基于SOS修复的Umu试验菌株（TA1535）。目前在鼠伤寒沙门氏菌回复突变检测体系中尚无针对大于4bp寡核苷酸链插入或缺失的检测方法，该方法对超声等物理场诱变方法的优化和评价都有重要意义。

发明内容