[发明专利]一种CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种CRISPR‑cas9基因编辑系统递送载体及其制备方法和应用。所述CRISPR‑cas9基因编辑系统递送载体包括脂质纳米颗粒和离子液体。本发明同时采用脂质纳米颗粒和离子液体负载CRISPR‑cas9基因编辑系统，能够提高基因编辑效率，此外，控制咪唑型离子液体1‑烷基‑3‑甲基咪唑阳离子([C_nmim]⁺)的烷基链长度或制备过程中脂质纳米颗粒溶液、CRISPR‑cas9基因编辑系统溶液和离子液体溶液的混合顺序，能够进一步提高基因编辑效率。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种CRISPR-cas9基因编辑系统递送载体及其制备方法和应用。

背景技术

基因治疗通过将外源正常基因导入靶细胞，以纠正异常基因表达缺陷引起的疾病，以达到治疗目的，有希望纠正人类的各种疾病和缺陷。CRISPR-cas9基因编辑系统的出现为基因编辑提供了一种简单有效的方法，促进了基因疗法的发展，为治疗遗传疾病提供了新的途径。

CRISPR-cas9基因编辑系统由单导向RNA(sgRNA)和Cas9蛋白组成，sgRNA识别其在基因组中的靶序列，Cas9蛋白在sgRNA的引导下对靶序列进行切割，CRISPR-cas9系统的具有多样性、模块化和有效性的特点，已经成为目前细胞基因组工程中最强大的平台。目前，CRISPR-cas9已经被用于基因删除、基因突变、转录激活和基因筛查，在眼科学、神经科学、免疫学、内分泌、癌症研究、基因筛查、疾病诊断和药物靶点的研究领域均得到应用。

虽然CRISPR-cas9系统在基因编辑上虽然具有巨大的潜力，但是如何进行CRISPR-cas9 系统的安全、有效和准确的递送是将其用于治疗时面临的重大挑战。目前，CRISPR-cas9系统通过三种形式进行递送：(1)递送编码Cas9蛋白和sgRNA的质粒；(2)递送Cas9mRNA 和单独的sgRNA的混合物；(3)递送Cas9蛋白和sgRNA形成的核糖核蛋白(RNP)复合物，其中，递送RNP复合物作用迅速、基因编辑效率高、同时能降低毒性和免疫反应。

脂质纳米颗粒是目前最常用的CRISPR-cas9递送系统之一，带负电的核酸能和带正电的脂质通过电荷作用形成脂质纳米颗粒，并且能保护核酸免受核酸酶的降解，并通过内吞作用或巨胞饮作用进入靶细胞。脂质纳米颗粒具有易制备，安全性好的优点，脂质纳米粒能够有效地将RNP复合物传递到小鼠大脑中进行体内基因编辑，如CN111246846A公开了一种可用于体内递送生物活性剂的组合物，所述组合物包含阳离子脂质、辅助脂质和生物稳定性增强剂，能够递送RNP复合物等生物活性剂，但是脂质纳米颗粒递送效率较低，尤其是在递送同时包含核酸和蛋白的RNP复合物上，由于Cas9蛋白带正电荷，使得负载效率较低，因此需对脂质纳米颗粒或RNP复合物进行修饰。

Zuris等(参见：Zuris JA,Thompson D B,Shu Y,et al.Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editingin vitro and in vivo[J].Nature Biotechnology,2014,33(1):73-80)将带负电的绿色荧光蛋白GFP融合到Cas9蛋白上，使Cas9 蛋白融合蛋白和sgRNA组成的RNP复合物能被常规的带正电荷的脂质颗粒递送，结果表明，利用阳离子脂质传递GFP-Cas9:sgRNA复合物可以高效地对靶基因进行修饰，其特异性显著高于递送表达Cas9和sgRNA的DNA。

但是，对脂质纳米颗粒或RNP复合物进行化学修饰会增加操作技术的复杂性，对纳米颗粒或RNP复合物的结构、稳定性和活性会产生不确定的影响，并且通用性较差。

因此，提供一种简单高效、且操作简单的核糖核蛋白递送载体对于基因编辑具有重要意义。

发明内容