[发明专利]一种用于结直肠癌多基因ctDNA的检测方法

说明书

本发明公开了一种用于结直肠癌多基因ctDNA的检测方法，具体包括以下步骤：S1、收集有治疗前组织标本，S2、血液样本处理，S3、cfDNA提取，S4、测定浓度，检测片段大小，S5、混合离心，S6、ddPCR检测阶段，S7、荧光信号的读取，S8、数值结果分析，本发明涉及分子诊断基因检测技术领域。该用于结直肠癌多基因ctDNA的检测方法，过和内参基因β‑Actin的特异性检测引物和探针对cfDNA进行ddPCR扩增，并对扩增产物进行检测，最后对荧光信号数据进行分析，获得KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因和内参基因β‑Actin荧光信息，血浆ctDNA可能替代肿瘤组织活检，作为结直肠癌辅助诊断的分子标志物，动态监测西妥昔单抗治疗前和治疗过程中患者ctDNA中RAS(KRAS、NRAS)、BRAF、PIK3CA基因突变状态的变化。

技术领域

本发明涉及分子诊断基因检测技术领域，具体为一种用于结直肠癌多基因ctDNA的检测方法。

背景技术

目前临床结直肠癌基因检测基本上取材于肿瘤组织，但是组织获取为有创性操作，难以在同一例病人无法反复多次进行，特别是对于晚期病人，取材就更加困难。这就意味着在组织标本丢失、不足或疾病进展而活检困难时无法准确的为患者制定个体化的治疗方案，这也限制了原发性耐药及继发性耐药的分子机制研究。因此，临床上探讨适用范围广、痛苦小、准确度高、成本低的基因检测方法显得至关重要。

ctDNA基因检测是一项非侵入式检测肿瘤的“液体活检”技术，相对于传统的组织活检简单、易行、高重复性，更易被患者接受。在满足两者对mCRC患者突变基因检测结果一致性较好的前提下，有望成为替代组织活检的新的检测方式。

针对之一问题，本发明提供了一种检测方法，通过采用提取结直肠癌患者的外周血，分离血浆，提取游离核酸，检测转移性结直肠癌(mCRC)患者血浆ctDNA中RAS(KRAS、NRAS)、PIK3CA、BRAF基因突变状态，KRAS突变主要定位在第12、13、61和63号密码子，其中有7个突变热点：Gly12Asp、Gly12Val、Gly12Ser、Gly12Cys、Gly12Ala、Gly12Arg和Gly13Asp共7类热点突变，占KRAS基因总突变的90％以上。作为ras家族的一员，NRAS在结构和功能上都与KRAS具有很多相似性，在非KRAS基因exon2突变的结直肠癌患者中，NRAS基因突变占7.5％(48/641)。NRAS基因有7种常见突变。KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF都是EGFR下游的信号分子，是众多信号通路上关键的激活因子。这些基因的突变常见于多种恶性肿瘤，在结直肠癌患者中的突变率分别为20～50％、1～6％、10～30％、8～15％。KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因突变一般会使结直肠癌患者对抗EGFR抗体类药物产生耐药。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于结直肠癌多基因ctDNA的检测方法，可替代有创伤性的肿瘤组织活检，ctDNA获取容易，更易被患者接受，ctDNA是肿瘤细胞通过凋亡、坏死或者自分泌的形式释放至外周血的游离DNA,其携带的肿瘤基因组信息与肿瘤组织具有良好的一致性，能克服常规肿瘤组织活检所无法突破的肿瘤异质性问题。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种用于结直肠癌多基因ctDNA的检测方法，具体包括以下步骤：

S1、收集有治疗前组织标本的KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因检测结果的mCRC患者若干例，分别包括若干例患者未接受过任何治疗，若干例患者接受了原发灶姑息性切除手术，若干例患者接受过一线以上化疗，肿瘤组织标本基因检测采用Amoy-Dx试剂盒；