[发明专利]一种用于结直肠癌多基因ctDNA的检测方法

权利要求书

1.一种用于结直肠癌多基因ctDNA的检测方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

S1、收集有治疗前组织标本的KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF基因检测结果的mCRC患者若干例，分别包括若干例患者未接受过任何治疗，若干例患者接受了原发灶姑息性切除手术，若干例患者接受过一线以上化疗，肿瘤组织标本基因检测采用Amoy-Dx试剂盒；

S2、血液样本处理：获得血液后，在4h内处理做以下处理：取外周血10mL，1600g，4℃离心10min，分离为血浆和血细胞，血细胞于-80℃保存，将上清液，即血浆，进行第二次离心，16000g，4℃离心10min，移取上清液转并移至保存管中，置于-80℃保存备用，即血浆样本。

S3、cfDNA提取：采用核酸提取纯化试剂盒进行cfDNA提取；

S4、采用Life Qubit 2.0测定提取的cfDNA的浓度，Agilent 4200TapeStation核酸分析仪检测提取的cfDNA的片段大小；

S5、PCR反应体系涡旋仪混合，于掌式离心机离上离心，去除气泡，然后将反应体系转移至ddPCR检测区；

S6、ddPCR检测阶段：该阶段在ddPCR检测区完成，首先制备微滴，再PCR扩增，然后将含有制备好的微滴的96孔板转移至QX200微滴分析仪，设置反应参数，编辑样品信息，对所有样本进行荧光检测，微滴读取结束后，保存数据，进行下一步分析；

S7、荧光信号的读取；

S8、数值结果分析：收集首次或正在接受西妥昔单抗治疗的KRAS、NRAS、PIK3CA、BRAF野生型mCRC患者若干例，检测治疗前或疗效评估时血浆ctNDA中KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、基因状态。

2.根据权利要求1所述的一种用于结直肠癌多基因ctDNA的检测方法，其特征在于：所述步骤S3中核酸提取纯化试剂盒选用重鼎ZD-YL-Midi-40试剂盒。

3.根据权利要求1所述的一种用于结直肠癌多基因ctDNA的检测方法，其特征在于：所述步骤S3中cfDNA提取的具体步骤如下：

A1、取10mL离心管，加入20μL Proteinase K，再加入2mL“1.血液样本处理”收集的血浆样本，加入2mL溶液GH，漩涡混合15s，然后于恒温水浴锅内37℃孵育10min；

A2、上述混合液中加入2mL异丙醇，充分漩涡混合；然后，置于4℃冰箱中孵育10min，将混合液移入套有收集管的中量离心柱，10000rpm离心1min，弃去收集管中废液；

A3、向步骤A2、的离心柱中加入2.5mL溶液W1A，10000rpm离心3min，取出离心柱后弃去收集管中废液，将离心柱放回，其中，溶液W1A按照说明书要求加入无水乙醇；

A4、向步骤A3的离心柱中加入4mL溶液W2，10000rpm离心3min，去除废液，其中，溶液W2按照说明书要求加入无水乙醇；

A5、向步骤A4的离心柱中加入2mL无水乙醇，10000rpm离心3min，将离心柱小心取出，转移至新的15mL离心管中，开盖室温放置10min，使残余乙醇挥发；

A6、向离心柱中加入提前预热的TE溶液450μL，室温静置5min后，10000rpm离心3min；

A7、弃去15mL离心管内的中量离心柱，向管内洗脱液中加入450μL溶液BK与450μL无水乙醇，涡旋混匀，混匀后室温静置5-10min；

A8、取含有收集管微量离心柱，将700μL步骤A7的混匀液移入微量离心柱中，封盖13000rpm离心30s，弃废液，重复操作，直至混匀液全部过柱；

A9、13000rpm，空转2min，然后室温静置5min，挥发残留乙醇；

A10、将离心柱取出并转移至1.5mL干净的离心管中，然后向柱中加入43μL溶液NFwater，室温静置5min后13000rpm离心2min，其中，溶液NF water可50～60℃预热，提高洗脱效率；

A11、将离心下来的溶液重新移入离心柱内，将离心柱放在离心管中，开盖室温静置2min，13000rpm离心3min，滤液即提取的cfDNA。