[发明专利]用于辨别菊花白色锈病抗性的CAPS分子标记及其应用

说明书

本发明涉及一种用于辨别菊花白色锈病抗性的分子标记，所述分子标记为酶切扩增多态性序列(CAPS)，所述酶切扩增多态性序列(CAPS)的原始序列的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。本发明的分子标记在菊花任意发育时期均可用于辨别菊花白色锈病抗性，在菊花白色锈病抗性鉴定与抗病品种选育方面具有重要的科学指导意义。

技术领域

本发明属于植物分子领域，具体涉及一种辨别菊花白色锈病抗性的CAPS分子标记及其应用，可用于菊花白色锈病抗性鉴定及分子标记辅助选择育种。

背景技术

菊花(Chrysanthemum morifolium)是菊科菊属多年生宿根草本植物，是我国十大传统名花之一。菊花种类繁多、花型多变、色彩丰富，具有极高的观赏与经济价值，在园林绿化中广泛应用。菊花白色锈病是由堀氏菊柄锈菌(Puccinia horiana Henn.)引起的菊花专性寄生病害，发病时危害菊花叶片、幼茎、花部，乃至整个植株枯萎死亡，极大的降低了菊花观赏性。菊花白色锈病是世界性检疫病害，传染范围广泛，是菊花生产过程中最重要的破坏性病害之一，大面积发病将造成菊花产业的巨大损失，严重制约了菊花产业的发展。

分子标记辅助育种具有快速鉴定目标性状，方法简便、价格低廉，主要应用在植物基因分型、分子标记辅助选择育种、品种鉴定等方面。目前尚无通过分子标记鉴定菊花白色锈病性状的方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种用于辨别菊花白色锈病抗性的分子标记及其应用，能够在菊花任意发育阶段辨别菊花材料对菊花白色锈病的抗性，加快菊花育种进程。本发明是通过如下技术方案实现的：

一种用于辨别菊花白色锈病抗性的分子标记，所述分子标记为酶切扩增多态性序列(CAPS)，所述酶切扩增多态性序列(CAPS)的原始序列的上游引物的核苷酸序列为SEQ IDNO：1，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

另一方面，本申请还保护一种根据上述的分子标记辨别菊花白色锈病抗性的方法，包括如下步骤：

(1)菊花基因组DNA提取：

采用CTAB法，提取待测菊花基因组DNA；

(2)PCR扩增全长序列：

PCR反应体系：包括2×高保真Taq酶缓冲液5μL，DNA模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，去离子水2μL；

PCR反应条件：98℃预变性3分钟；98℃变性10秒，45℃退火30秒，72℃延伸3分钟30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存；

(4)全长序列纯化与克隆载体连接

①全长序列纯化：利用琼脂糖凝胶纯化回收试剂对目的片段进行纯化；

②目的片段连接克隆载体后转化大肠杆菌感受态；

(4)阳性质粒鉴定与测序：

选取单菌落至含有50mg/L的卡那霉素的LB液体培养基中，200rpm条件下在37℃孵育12小时，菌液浑浊后，进行PCR验证，引物为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；

利用质粒快速提取试剂盒提取质粒；

(5)用质粒为模板，PCR扩增所述分子标记原始序列

PCR反应体系：包括2×Taq酶缓冲液5μL，质粒模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，去离子水2μL；

PCR反应条件：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸45秒，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存；

(6)限制性内切酶NlaШ酶切质粒PCR的产物：