[发明专利]用于辨别菊花白色锈病抗性的CAPS分子标记及其应用

权利要求书

1.一种用于辨别菊花白色锈病抗性的分子标记，其特征在于，所述分子标记为酶切扩增多态性序列(CAPS)，所述酶切扩增多态性序列(CAPS)的原始序列的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

2.一种根据权利要求1所述的分子标记辨别菊花白色锈病抗性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)菊花基因组DNA提取：

采用CTAB法，提取待测菊花基因组DNA；

(2)PCR扩增全长序列：

PCR反应体系：包括2×高保真Taq酶缓冲液5μL，DNA模板1μL，核苷酸序列为SEQ ID NO：3的上游引物1μL，核苷酸序列为SEQ ID NO：4的下游引物1μL，去离子水2μL；

PCR反应条件：98℃预变性3分钟；98℃变性10秒，45℃退火30秒，72℃延伸3分钟30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存；

(3)全长序列纯化与克隆载体连接

①全长序列纯化：利用琼脂糖凝胶纯化回收试剂对目的片段进行纯化；

②目的片段连接克隆载体后转化大肠杆菌感受态；

(4)阳性质粒鉴定与测序：

选取单菌落至含有50mg/L的卡那霉素的LB液体培养基中，200rpm条件下在37℃孵育12小时，菌液浑浊后，进行PCR验证，引物为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；

利用质粒快速提取试剂盒提取质粒；

(5)用质粒为模板，PCR扩增所述分子标记原始序列

PCR反应体系：包括2×Taq酶缓冲液5μL，质粒模板1μL，核苷酸序列为SEQ ID NO：1的上游引物1μL，核苷酸序列为SEQ ID NO：2的下游引物1μL，去离子水2μL；

PCR反应条件：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸45秒，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存；

(6)限制性内切酶NlaШ酶切质粒PCR的产物：

限制性内切酶NlaШ识别序列为CATG^；

酶切反应体系：PCR产物6μL，NlaШ限制性内切酶0.5μL，10×酶切缓冲液1.5μL，去离子水4μL；

酶切反应条件：37℃酶切60分钟；

(7)酶切上述PCR产物后，进行琼脂糖凝胶电泳检测：

经凝胶成像仪成像后，当显示出523bp和99bp两条特异性条带时，为抗白色锈病的菊花；当显示出643bp特异性条带时，为感白色锈病的菊花。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中②的具体步骤如下：

取①中获得的PCR纯化产物4μL，克隆载体溶液1μL，轻轻混合后25℃连接25分钟；连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，冰浴30分钟后42℃水浴热激90秒，再冰浴2分钟；加入LB液体培养基600μL，200rpm条件下在37℃孵育1小时；取浑浊菌液200μL均匀涂布于加入50mg/L的卡那霉素的LB固体培养基上，37℃条件下倒置培养过夜。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述Taq酶缓冲液含Taq酶0.2U、dNTPs1μM及镁离子。

5.根据权利要求2-4之一所述的方法，其特征在于，所述方法在菊花发育任意时期均可鉴定菊花是否抗菊花白色锈病。