[发明专利]分子印迹智能凝胶光栅及其制备方法与凝血酶检测方法

说明书

本发明提供了一种分子印迹智能凝胶光栅及其制备方法，所述该凝胶光栅由基底和基底上的相互平行的凝胶条组成，凝胶条之间的间隙为凝胶光栅的狭缝，所述凝胶条由凝血酶响应型分子印迹凝胶构成；所述凝血酶响应型分子印迹凝胶是由含凝血酶印迹复合物的凝胶在洗脱掉凝胶网络中的凝血酶后形成的。本发明还提供了基于分子印迹智能凝胶光栅的凝血酶检测方法。本发明可提高凝血酶检测的灵敏度和便捷性，所述凝血酶检测方法的检出限低至10^‑12mol/L，能实现对10^‑12～10^‑7mol/L浓度级别的凝血酶的检测，特别适用于超灵敏定量检测尿液中凝血酶。

技术领域

本发明属于生物标志物检测领域，涉及分子印迹智能凝胶光栅及其制备方法，以及基于所述分子印迹智能凝胶光栅的凝血酶检测方法。

背景技术

凝血酶是一种多功能的丝氨酸蛋白酶，它作为凝血瀑布中主要的效应蛋白质，可以促使血浆中的可溶性纤维蛋白原转变成不溶的纤维蛋白，实现速效止血。同时，凝血酶还作为激素调节血小板聚集、内皮细胞激活和生物血管中的其他重要响应。更重要的是，最近的报道指出，凝血酶还可作为尿液中的生物标志物，用于检测肾小球肾炎、肝炎、狼疮、糖尿病以及癌症等疾病信号。因此，实现凝血酶的灵敏检测具有非常重要的意义。

对于凝血酶的检测，虽然凝血分析仪等仪器具有较高的精度，但该方法需要依赖大型昂贵的分析设备和专业人员的操作，无法满足便捷的检测需求，因而目前研究较多的主要是生物传感器检测法。王晓工课题组通过将凝血酶特异性适配体及其互补序列共聚到凝胶网络内部，制备了适配体功能化的凝胶衍射光栅。当凝胶光栅与凝血酶特异性适配体相互作用时，会使适配体与互补序列之间的相互作用被破坏，导致光栅的几何参数和折射率改变，从而实现对凝血酶的检测。但在他们的实验中，仅使用了一种能识别凝血酶的适配体，且直接将适配体共聚到凝胶网络中，导致凝血酶与适配体的结合位点不足，因而对凝血酶的检测限仅到0.1μM。正常情况下，在凝血过程中，人血液中凝血酶的浓度会在nM与较低的μM之间变化。为了实现凝血酶的检测，目前用于凝血酶检测的生物传感器检测方法需要进行荧光标记或采用额外的信号增强方式，存在着检测操作过程繁琐、检测设备昂贵以及检测限高等问题，无法达到实际需求。因此，开发出可用于凝血酶灵敏便捷检测的方法是十分必要的。

近年来，随着分子印迹技术的迅速发展，分子印迹材料已被应用于生物传感器的构建之中。分子印迹技术也叫分子模板技术，当模板分子与聚合物单体接触时会有多重作用点，在单体聚合过程这种结合作用会被记忆下来，当模板分子去除后，聚合物中会形成与模板分子空间结构相匹配、具有空间位点的空穴。由于分子印迹技术形成的分子印迹聚合物具有良好的空间三维形态，因此模板分子的去除不会影响作用位点的再结合能力。分子印迹技术由于其特有的构效预定性、特异识别性和实用性等特点，在蛋白质、DNA、细胞以及病毒等生物大分子的检测识别中已有应用。Spivak课题组利用凝血酶作为模板，使用分子印迹技术制备了适配体功能化的水凝胶，利用适配体对凝血酶的特异性识别能力，直接测量水凝胶的体积变化实现对凝血酶的检测，但是该方法依靠手工测量凝胶体积变化，产生的误差很大，检测的准确度有待提高。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供分子印迹智能凝胶光栅及其制备方法，以及基于所述分子印迹智能凝胶光栅的凝血酶检测方法，以提高凝血酶检测的灵敏度和便捷性。

本发明的主要技术构思：将分子印迹技术与智能凝胶光栅传感技术相结合，以凝血酶作为印迹模板、以两种可与凝血酶不同位点结合的凝血酶特异性核酸适配体A1和凝血酶特异性核酸适配体A2，以及N-异丙基丙烯酰胺作为共聚单体，与交联剂一起聚合得到凝胶网络，之后再去除凝胶网络中的印迹模板，得到可特异性识别凝血酶的分子印迹智能凝胶，将该分子印迹智能凝胶与智能凝胶光栅传感技术结合，制备成可特异性识别凝血酶而引起衍射光强度变化的分子印迹智能凝胶光栅，以实现对凝血酶的灵敏传感检测。

为实现上述发明目的，本发明提供的技术方案如下：