[发明专利]一种标记及追踪CD133阳性室管膜细胞的重组质粒、构建方法及鉴定方法

说明书

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种标记及追踪CD133阳性室管膜细胞的重组质粒、构建方法及鉴定方法。所述重组质粒是以质粒pCAG‑cre为载体，在质粒pCAG‑cre限制性酶切位点SpeI和EcoRI之间插入CD133‑promoter2基因得到的CD133‑promoter2‑Cre重组质粒，所述CD133‑promoter2基因序列为SEQ ID NO:1所示。当本发明提供的重组质粒在活体内成功电转染到ROSA26‑LacZ小鼠的CD133阳性室管膜细胞中，通过β‑gal免疫荧光染色可以检测到转染成功的CD133阳性的室管膜细胞和它们的子代细胞，从而可以观察到CD133阳性的室管膜细胞的迁移路径和分化情况。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种标记及追踪CD133阳性室管膜细胞的重组质粒、构建方法及鉴定方法。

背景技术

在成体哺乳动物的大脑中，神经干细胞（NSCs）存在于许多地方，例如海马齿状回、嗅球、室管膜下区等，其中在前脑中生成神经元和胶质细胞的NSCs分布的区域主要是脑室区（VZ）与室下区（SVZ）。紧临室管膜细胞的SVZ是由具有迁移特性的成神经细胞，星形胶质细胞样形态的NSCs和快速分裂及短暂扩增的NSCs组成，室管膜细胞因与SVZ临近，被认为具有神经干细胞的属性。CD133/Prominin-1是细胞表面含5次跨膜结构的糖蛋白分子，在分离小鼠NSCs时被发现，也表达在多种组织干细胞和肿瘤干细胞中。通常CD133标记的室管膜细胞广泛分布于脑室的室管膜下区和SVZ中，正常情况下CD133阳性的室管膜细胞是处于静息状态（qNSC），当机体遭受损伤或受到信号通路调控时，CD133阳性室管膜细胞会从静息状态被激活而具有NSCs属性，形成短暂扩增细胞（TAC）并迅速分化为成神经母细胞并沿喙侧迁移流迁移到其它部位（如嗅球），表明体内静息状态的室管膜细胞仍保留细胞分裂的能力，在受到损伤时被激活成具有NSCs属性并产生新的神经元。NSCs如何平衡增殖和分化这个问题不仅是神经生物学今后发展的关键问题，而且与脑肿瘤形成、中枢神经系统畸形、神经衰老和中风等临床疾病高度相关。因此可靠的追踪CD133阳性室管膜细胞的方法在研究如何防止和治疗中风、神经衰老、胶质细胞瘤等疾病的发生中具有重要的科学和临床意义。

目前检测CD133阳性室管膜细胞的方法是通过CD133抗体进行免疫荧光染色标记，但是无法追踪室管膜细胞及其子代细胞的迁移路径以及分化的情况。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种标记及追踪CD133阳性室管膜细胞的重组质粒、构建方法及鉴定方法。

本发明所采取的技术方案如下：一种标记及追踪CD133阳性室管膜细胞的重组质粒，所述重组质粒是以质粒pCAG-cre为载体，在质粒pCAG-cre限制性酶切位点SpeI和EcoRI之间插入CD133-promoter2基因得到的CD133-promoter2-Cre重组质粒，所述CD133-promoter2基因序列为SEQ ID NO:1所示。

如上所述的标记及追踪CD133阳性室管膜细胞的重组质粒的构建方法，包括以下步骤：

（1）人工合成带有酶切位点SpeI和EcoRI序列的CD133-promoter2产物；

（2）将带有酶切位点SpeI和EcoRI序列的CD133-promoter2产物经SpeI和EcoRI双酶切，回收纯化带有CD133-promoter2基因的目的片段；

（3）将质粒pCAG-cre经SpeI和EcoRI双酶切，回收纯化酶切后的质粒pCAG-cre片段；

（4）将步骤（2）得到的带有CD133-promoter2基因的目的片段和步骤（3）得到的质粒pCAG-cre片段酶连组装；

（5）将步骤（4）酶连组装得到的产物转移到受体菌或细胞中进行转化克隆，繁殖筛选得到阳性克隆株，表达提取得到CD133-promoter2-Cre重组质粒。