[发明专利]一种2型糖尿病易感肠道菌的检测方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种2型糖尿病易感肠道菌的检测方法及试剂盒。本发明利用多重荧光PCR技术，通过对引物、探针的设计筛选及反应体系的优化，建立了2型糖尿病易感肠道菌，即多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和毛螺菌的检测方法，实现了四种菌的一管多重检测，具有检测特异性强、灵敏度高、重复性好的优点，且操作简单方便、快速、节约耗材、成本低廉，可作为多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌以及毛螺菌的定性检测试剂，为2型糖尿病的研究提供快速、特异、可重复的检测手段。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域。更具体地，涉及一种检测2型糖尿病易感肠道菌的多重qPCR引物和探针、检测方法及试剂盒。

背景技术

随着我国经济、环境、生活水平的改变，糖尿病患病率逐年上升，其中2型糖尿病(T2DM)的患病比例更高。2型糖尿病被认为是由一系列危险因素引起的，如遗传、年龄、肥胖和不健康的生活方式等，越来越多的证据表明，2型糖尿病与肠道菌群的数量发展有着一定的相关性，通过检测肠道菌群，可以为2型糖尿病的诊断提供辅助证据。例如，中国专利CN109797190A公开了一种用于评估II型糖尿病风险的微生物标志物及其应用，其微生物标志物包括双歧杆菌属(Bifidobacterium)、普雷沃菌属(Prevotella)、梭菌属(Clostridium)、罗氏菌属(Roseburia)、肠球菌属(Enterococcus)或韦荣球菌属(Veillonella)中任意两种以上的组合。另有研究表明，多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)、柔嫩梭菌(Clostridium Leptum)、球形梭菌(Clostridium Coccoides)以及毛螺菌(Lachnospiraceae Bacterium)是2型糖尿病患者的易感肠道菌，糖尿病患者进食后，血糖值升高时，其丰度也会相应升高，可作为2型糖尿病风险的微生物标志物。

目前，肠道菌群的检测方法主要包括传统培养法和分子生物学法两大类。传统培养法是微生物鉴定的基本方法，但其存在耗时长、培养要求高、影响因素多等问题。分子生物学方法的出现则为肠道细菌的检测提供了更多可能，它具有检测时间短、灵敏度高、结果准确等优势，弥补了传统培养法的诸多不足，被广泛地应用于肠道微生态生物研究。其中，由于多重qPCR方法可同时检测多种肠道菌，具有检测速度快，成本低等优势，在肠道菌的检测方面应用广泛，但多重qPCR方法的建立难度比普通qPCR高很多，多重qPCR对引物和探针的特异性要求很高，否则会因同属内菌的DNA序列同源性较高，出现非特异性扩增，造成假阳性；引物和探针之间也不能相互干扰，否则将导致检测结果不准确；引物的扩增效率也会影响结果的准确性，如果引物的扩增效率相差较多，当在同一反应体系中同时进行扩增时，会因各引物间扩增效率的不同，导致样本初始DNA扩增的不均衡，一些含量低的菌或者引物扩增效率低的菌无法同含量高或者扩增效率高的引物竞争，导致此类菌的扩增产物较少，荧光信号较弱，造成假阴性结果。

虽国内外已有不少关于肠道菌的实时荧光PCR检测方法与应用的报道，例如中国专利CN 110904250A公开了用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物、试剂盒及检测方法，其可同时检测长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和阿克曼氏菌。但目前还未有同时检测2型糖尿病易感肠道菌，即多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌以及毛螺菌这四种2型糖尿病易感肠道菌的多重荧光PCR方法，因此，提供一种检测上述四种菌的多重qPCR方法对2型糖尿病的研究具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服尚未有同时检测多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和毛螺菌这四种2型糖尿病易感肠道菌的多重qPCR引物、探针方法及试剂盒的缺陷和不足，提供2型糖尿病易感肠道菌的检测方法及试剂盒。

本发明的目的是提供一种检测2型糖尿病易感肠道菌的多重qPCR引物和探针。

本发明的另一目的是提供一种2型糖尿病易感肠道菌的检测方法。

本发明的再一目的是提供一种2型糖尿病易感肠道菌的检测试剂盒。