[发明专利]一种2型糖尿病易感肠道菌的检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种检测2型糖尿病易感肠道菌的多重qPCR引物和探针，其特征在于，包括用于检测多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和毛螺菌的一对引物和四条探针；其中，用于同时检测多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌和毛螺菌的引物T2DM-F1/R1的序列依次如SEQ ID NO.1～2所示，用于检测多形拟杆菌的探针BT-P1的序列如SEQ ID NO.3所示，用于检测柔嫩梭菌的探针CL-P2的序列如SEQ ID NO.4所示，用于检测球形梭菌的探针CC-P1的序列如SEQ IDNO.5所示，用于检测毛螺菌的探针LB-P2的序列如SEQ ID NO.6所示，所述四条探针的5’端标记有不同的荧光发射基团，3’端标记有淬灭基团。

2.根据权利要求1所述引物和探针，其特征在于，SEQ ID NO.3所示探针的5’端荧光发射基团为FAM，SEQ ID NO.4所示探针的5’端荧光发射基团为VIC，SEQ ID NO.5所示探针的5’端荧光发射基团为Cy5，SEQ ID NO.6所示探针的5’端荧光发射基团为TEXAS RED，3’端淬灭基团均为BHQ1。

3.一种2型糖尿病易感肠道菌的检测方法，其特征在于，包含以下步骤：

S1.提取待测样本中的核酸；

S2.以步骤S1所得核酸为模板，用权利要求1所述引物和探针进行qPCR反应；

S3.反应结束后，通过探针序列上所携带的不同荧光通道曲线及Ct值判断结果，若出现扩增曲线且Ct值≤38，则代表对应菌的检测结果为阳性。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤S2所述qPCR反应的反应体系为：待检测核酸样本5μL，5×DNA PCR Buffer 5μL，40pmol/μL的T2DM-F1 0.25μL，40pmol/μL的T2DM-R1 0.25μL，20pmol/μL的BT-P1 0.15μL，20pmol/μL的CC-P1 0.5μL，20pmol/μL的CL-P2 0.5μL，20pmol/μL的LB-P2 0.25μL，酶系3μL，dNTPs 1μL，H₂O 9.1μL。

5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤S2所述qPCR反应的反应程序为：50℃，2min，1个循环；95℃，15min，1个循环；94℃，15sec，55℃，45sec，40个循环。

6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述酶系中含有热启动Taq酶和尿嘧啶DNA糖基化酶，所述dNTPs中还含有2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸盐。

7.一种2型糖尿病易感肠道菌的检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述多重qPCR引物和探针，dNTPs以及qPCR反应所需酶试剂。

8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述酶试剂为热启动Taq酶。

9.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有尿嘧啶DNA糖基化酶和含2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸盐的dNTPs。

10.根据权利要求7～9任一所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含多形拟杆菌、柔嫩梭菌、球形梭菌以及毛螺菌目的基因的重组质粒作为阳性质控品，以及灭菌生理盐水作为阴性质控品。