[发明专利]癌细胞膜内嵌的人骨微流控芯片及其制备方法与在分离循环肿瘤细胞中的应用

说明书

本发明公开了一种癌细胞膜内嵌的人骨微流控芯片及其制备方法与在分离循环肿瘤细胞中的应用，所述方法包括：将癌细胞株的细胞悬液进行培养，待所述癌细胞贴壁后洗涤并固定，获得癌细胞膜基底；后加入BSA溶液、NHS‑S‑S‑Biotin溶液进行孵育，将所述癌细胞膜基底于链酶亲和素溶液中浸泡，后PBS洗涤，加入将生物素化的抗EpCAM抗体溶液进行孵育，获得EpCAM抗体修饰的癌细胞膜基底；将所述EpCAM抗体修饰的癌细胞膜基底与人骨PDMS整合，获得癌细胞膜内嵌的人骨微流控芯片，简称MHB‑chip。该芯片可用体外对模拟血液样本和临床病人血液样本中微量CTCs进行特异性捕获和释放，捕获效率高且捕获纯度高。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种癌细胞膜内嵌的人骨微流控芯片及其制备方法与在分离循环肿瘤细胞中的应用。

背景技术

循环肿瘤细胞是从实体瘤脱落到外周血中的肿瘤细胞，循环肿瘤细胞会随着外周血扩散到其他位置，癌细胞的转移增殖是是肿瘤病人死亡的主要原因。循环肿瘤细胞携带着肿瘤病人的全部基因信息，可以作为液体活检的重要手段之一，这会为病人的诊断，个性化治疗和术后评估提供重要的依据。然而，我们知道每毫升血液中可能仅有几个CTC，因此迫切需要开发从血液中的分离出稀少的循环肿瘤细胞的技术。过去几十年来，许多专家根据CTC的物理化学性质开发了很多富集的方式。比如磁性分离，尺寸分离，微流控分离等。其中，微流控设备因为其易制造，成本低，且可以高效处理复杂的细胞流体等优点在CTC富集研究方面具有重要的优势。

抗体修饰的基底与几何图像结合的微流控设备被认为是一种很有前景的可以高效分离CTC的装置。其中，人骨芯片可以增强样本与抗体修饰的基底的接触，进而增强对CTC的分离效率。同时，为了更大增加两者的接触机会，修饰了抗体的纳米结构的基底的微流控被广泛作为研究。其中，纳米球，纳米柱，纳米纺丝等基底不仅仅增大了基底的粗糙度，而且增大基底与细胞的接触面积，从而达到了提高细胞捕获效率的目的。然而这种纳米基底在提高目的细胞的捕获效率的同时，也造成了大量背景细胞非特异性粘附在纳米基底。传统的整体释放细胞的方法往往是通过对整个基底的作用来达到富集CTC的目的。

然而上述这种方式将靶细胞和非特异性粘附的背景细胞一起释放，会导致富集的CTC的纯度低，不利于对CTC进行下游分析。也有从基底上回收单细胞的技术，比如激光切割，微操作，流式细胞分选等，然而，现有的单细胞分离的方法往往需要借助外来的设备，成本较高且细胞捕获效率不高。

因此，急需开发出一种同时保证细胞捕获效率和捕获纯度的方法来富集CTC的方法或者材料工具，成为亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明目的是提供一种癌细胞膜内嵌的人骨微流控芯片及其制备方法与在分离循环肿瘤细胞中的应用，该癌细胞膜内嵌的人骨微流控芯片可用体外对模拟血液样本和临床病人血液样本中微量CTCs进行特异性捕获和释放，捕获效率高且捕获纯度高。

在本发明的第一方面，提供了一种癌细胞膜内嵌的人骨微流控芯片的制备方法，所述方法包括：

将癌细胞株的细胞悬液进行培养，待所述癌细胞贴壁后洗涤并固定，获得癌细胞膜基底；

将所述癌细胞膜基底于BSA溶液和NHS-S-S-Biotin溶液进行孵育，后在链酶亲和素溶液中浸泡，后PBS洗涤，加入将生物素化的抗EpCAM抗体溶液进行孵育，获得EpCAM抗体修饰的癌细胞膜基底；

将所述EpCAM抗体修饰的癌细胞膜基底与人骨PDMS整合，获得癌细胞膜内嵌的人骨微流控芯片，简称MHB-chip。

进一步地，所述固定采用质量为分数为2～3％的戊二醛溶液。

进一步地，所述癌细胞株包括乳腺癌细胞株、前列腺癌细胞株、结肠癌细胞株、肝癌细胞株、胃癌细胞株和肺癌细胞株中的一种。