[发明专利]一种可替代苏通马铃薯培养基的卡介菌菌种传代培养方法

说明书

本发明公开了一种可替代苏通马铃薯培养基的卡介菌菌种传代培养方法，属于生物制品生产技术领域。本发明提供了可直接替代罗氏鸡蛋培养基菌种在苏通马铃薯培养基上的传代培养的方法，其中，具体包括：卡介菌工作种子批在罗氏鸡蛋培养基上复苏后，洗脱、研磨，接种至苏通培养基中，37‑39℃条件下培养10‑15d，生成菌膜。本培养方法制备的菌膜可完全替代苏通马铃薯培养基培养生成的菌膜，进行菌种保存，不仅可提高菌种产量，同时，还简化了菌种传代工艺，方便后续接种和使用。

技术领域

本发明涉及一种可替代苏通马铃薯培养基的卡介菌菌种传代培养方法，尤其涉及一种卡介菌菌种在罗氏鸡蛋培养基上复苏后、继续传代培养（苏通培养基上培养）并保存菌种的方法，属于生物制品生产技术领域。

背景技术

在治疗用卡介苗的制备过程中，一般采用如下的传代培养方法：卡介菌工作种子批直接在苏通马铃薯培养基上复苏培养后，收取，作为后面继续传代培养的中间菌种保存于2-8℃环境中。此方法的弊端在于：1支卡介菌工作种子批只能接种2支苏通马铃薯培养基，数量较少，难以满足工业需求，且卡介菌工作种子批在苏通马铃薯培养基上复苏效果不佳，培养时间长（14-18天）。另外，由于仅苏通马铃薯培养基菌种可放于2-8℃环境中保存两个月，可直接用于后续传代扩大培养，进行工业生产，因此苏通马铃薯培养基至关重要，而目前尚无成熟的市售苏通马铃薯培养基，常需要自己手工制作，这就存在诸多弊端，包括：

一、苏通马铃薯培养基中的原料马铃薯高压灭菌后易糊汤，马铃薯软烂，造成接种困难；

二、随着培养时间延长，苏通马铃薯培养基中液体挥发，导致涂抹菌种不易生长至苏通培养基液面，造成传代培养困难；

三、苏通马铃薯培养基制备为手工操作，难以保证每支马铃薯块的一致性；

四、苏通马铃薯培养基斜面接种菌液时，往往由于操作不稳，导致菌液溢出至苏通培养基液面中，造成菌种无法培养；

五、苏通马铃薯培养基的制作需要特制的培养盘和有颈试管，其均需定制，成本较高，且采用的培养盘占较大的培养空间等。

现有技术CN109722398A中公开了一种有利于卡介菌浮膜生长的苏通马铃薯培养基制备方法，其中，具体涉及卡介菌传代培养过程中所必须使用的苏通马铃薯培养基全新的制备过程。此外，CN103305567A中公开了卡介菌复合多糖及其制备方法和用途，其中，提及到“将含有卡介菌标准菌株的传代培养物继续接种于苏通培养基进行扩展培养至生长成乳白色至暗橙色菌膜，然后将菌膜煮沸提取用于多糖的生产”，以及苏通液体培养基的制备、菌种的扩大保存及液体培养步骤。以及，CN103923851A中公开一种卡介菌多糖核酸制备过程中的斜面培养新工艺，其中，具体公开：挑选在苏通马铃薯培养基上生长饱满、色浅黄、形状干皱成团、长势良好的菌苔作为菌种，进行传代；将接菌后的苏通马铃薯培养基置于培养室内培养，菌种管放置与水平面呈30-35°角，成斜面培养，培养温度：37±2℃；湿度：45-75%；培养时间：20-25天。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种可替代苏通马铃薯培养基的卡介菌菌种传代培养方法。其中，所培养的菌膜可完全替代苏通马铃薯培养基培养生成的菌膜，一方面方便进行菌种保存，另一方面可有效提高菌种传代培养产量，同时简化了传代培养工艺，方便后续接种和使用。

为了实现上述技术目的，提出如下的技术方案：

一种可替代苏通马铃薯培养基的卡介菌菌种传代培养方法，包括如下步骤：

A．复苏：将卡介菌工作种子批接种罗氏鸡蛋培养基上复苏，得罗氏鸡蛋培养基菌种；

B．洗脱：向罗氏鸡蛋培养基菌种加入浸润液，浸润3-5min，洗脱；其中，浸润液为苏通培养基、生理盐水或PBS进行浸润，优选苏通培养基；采用苏通培养基浸润，旨在润滑菌种与罗氏鸡蛋培养基表面的粘附性，便于洗脱；

C．研磨：将经洗脱后的菌液加入至研磨器中，研磨，形成均匀的菌悬液；

D．培养：将菌悬液接种至苏通培养基中，在37-39℃条件下静置培养10-14d，生成菌膜，收获菌膜，备用。