[发明专利]一种利用调控元件合成的爆炸物分子生物感应器及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种利用调控元件合成的爆炸物分子生物感应器及其制备方法和应用，该爆炸物分子生物感应器包括自发光操纵子luxABCDE operon的报告元件、启动子nahR的感应元件、RsrR调控蛋白及下游受其调控的tetH启动子；该爆炸物分子生物感应器使得nahR启动子感应爆炸物分子的信号通过RsrR‑Psubgt;tetH/subgt;调控元件级联放大，增强感应爆炸物分子后产生的自发光信号，提高检测的灵敏度，建立了通过调控蛋白调控元件级联放大启动子感应爆炸物分子信号的方法及生物传感器，该传感器的检测范围宽、灵敏度高、方法简便、成本低、安全性强，可应用于环境保护和维护国家安全等领域。

技术领域

本发明涉及基因工程和分子生物学技术领域，特别是涉及一种利用调控元件合成的爆炸物分子生物感应器及其制备方法和应用。

背景技术

生物感应技术是利用基因工程手段对菌株进行改造，使得该微生物在感应特定化合物或者特定化合物在微生物中的代谢产物后，微生物发生可以被检测的变化，从而达到对特定化合物进行检测的目的。这种生物传感器主要由感应元件和报告元件两部分构成，其中感应元件可特异性地感应靶标化合物，感应元件包括基因转录启动子、核糖体结合位点、终止子、转录调控因子等等；而报告元件可在感应元件的作用下而产生感应信号，一般常用的报告元件包括绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)和荧光素酶，分别产生对应颜色的荧光和自发光等可以被检测的感应信号。这些较为常见的报告元件的特点是技术成熟、容易操作，但是荧光和自发光的检测需要借助于分析仪器，还需要对荧光信号和自发光信号进行定量和定性分析。

爆炸物(例如地雷)的有效成份为2,4,6-三硝基甲苯(TNT)，TNT可自然分解为多种化合物，如1,3-二硝基苯(1,3-DNB)和2,4-二硝基甲苯(2,4-DNT)，其中2,4-DNT的稳定性最高，可在自然环境中长期存在。以色列科学家Shimshon Belkin于2014年报道了对爆炸物分子2,4-DNT的感应元件，即yqjF启动子，利用GFP作为报告元件，构建了检测2,4-DNT的生物感应系统，检测限达到0.01mg/L(New Biotechnology,2020,59,65-73)，处于国际上领先水平。此生物感应系统需使用仪器进行特定波长的紫外激发，以及绿色荧光信号的收集。另外，多种非GFP物质都能在紫外激发下发出绿色荧光，从而产生干扰信号。因此，该传感器的特异性较差，大大限制了其在复杂环境中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用调控元件合成的爆炸物分子生物感应器及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，该爆炸物分子感应器能够实现对爆炸物分子的实时荧光检测。

为实现上述发明目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种利用调控元件合成的爆炸物分子生物感应器的制备方法，包括以下步骤：

(1)扩增自发光操纵子luxABCDE operon基因片段、纯化回收后，与质粒pACYCDuet-1同时使用Not I和Kpn I进行双酶切，将luxABCDE operon基因片段与质粒酶切片段以2-5:1的摩尔比进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，于含抗生素的LB固体平板上筛选阳性克隆，验证并测序正确后得到重组质粒p-luxPleio；

(2)扩增启动子nahR基因片段，纯化回收后，其与重组质粒p-luxPleio利用PstI进行单酶切，将质粒酶切片段与nahR基因片段以2-5:1的摩尔比进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，于含抗生素的LB固体平板上筛选阳性克隆，验证并测序正确后得到重组质粒p-nahR-luxpleio；