[发明专利]一种利用调控元件合成的爆炸物分子生物感应器及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种利用调控元件合成的爆炸物分子生物感应器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）扩增自发光操纵子luxABCDE operon基因片段、纯化回收后，与质粒pACYCDuet-1同时使用Not I和Kpn I进行双酶切，将luxABCDE operon基因片段与质粒酶切片段以2-5:1的摩尔比进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，于含抗生素的LB 固体平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒p-luxPleio；

（2）扩增启动子nahR基因片段，纯化回收后，其与重组质粒p-luxPleio利用PstI进行单酶切，将质粒酶切片段与nahR基因片段以2-5:1的摩尔比进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，于含抗生素的LB 固体平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒p-nahR-luxpleio；

（3）扩增调控蛋白RsrR与tetH启动子基因片段，纯化回收后，其与重组质粒p-nahR-luxpleio利用NotI进行单酶切，将质粒酶切片段与RsrR-P_tetH基因片段以2-5:1的摩尔比进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，于含抗生素的LB固体平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒p-nahR-RsrR-P_tetH-luxpleio；

（4）将重组质粒p-nahR-RsrR-P_tetH-luxpleio转化大肠杆菌感受态细胞，于含抗生素的LB固体平板上筛选阳性克隆，得到工程菌株MR-12；

（5）将工程菌株MR-12于含抗生素的LB液体培养基中培养活化，再转接至以葡萄糖为碳源且含有镁离子的M9液体培养基中培养，得到利用调控元件合成的爆炸物分子生物感应器；

所述自发光操纵子luxABCDE operon来源于：鲾鱼发光杆菌；

所述自发光操纵子luxABCDE operon的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述启动子nahR的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述调控蛋白RsrR与tetH启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

在步骤（5）中，将工程菌株MR-12于含氯霉素的LB液体培养基中培养活化，再转接至添加了60%葡萄糖和1 M硫酸镁溶液的M9液体培养基中培养生长至OD₆₀₀=0.2，得到利用调控元件合成的爆炸物分子生物传感器。

2.一种权利要求1所述的利用调控元件合成的爆炸物分子生物感应器的制备方法制备得到的利用调控元件合成的爆炸物分子生物感应器。

3.一种权利要求2所述的利用调控元件合成的爆炸物分子生物感应器在用于爆炸物分子的实时检测中的应用。

4.一种利用权利要求2所述的利用调控元件合成的爆炸物分子生物感应器实时检测爆炸物分子的方法，其特征在于，包括：将爆炸物分子生物感应器与待测样品以9:1的体积比混匀后，加入黑色酶标板后封闭，一方面利用科研级CCD相机进行曝光30 s的拍照检测；另一方面利用酶标仪恒温实时监测荧光强度RLU值，每10-20 min进行一次监测，共监测15-25h。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述爆炸物分子生物感应器能够感应到的爆炸物分子的浓度为10 μg/L，所述爆炸物分子为2,4-DNT。