[发明专利]基因突变位点的用途及突变位点检测方法

说明书

本发明属于医学技术领域，基因突变位点的用途及突变位点检测方法。主要公开了PTEN‑p.P248L基因位点、PTEN‑p.T319fs基因位点、BRAF基因V600E位点、NRAS基因Q61R位点、RET基因M918T位点、NRAS基因Q61K位点、HRAS基因Q61R位点等在在制备甲状腺癌防治药物和/或制备甲状腺癌检测试剂中的应用。突变PTEN基因至少包括下述一种位点突变：PTEN‑p.P248L位点突变，碱基变化为c.743CT；PTEN‑p.T319fs位点突变，碱基变化为c.955_956insAA。还公开了高通量测序中捕获方法。本发明提供了与甲状腺乳头状癌靶向用药相关的比例靠前的突变基因，因而可以有目的性的对这些位点进行检测，可以更好地用于辅助治疗，有效减小检测和数据分析的工作量，降低了检测时间和成本。

技术领域

本发明属于医学诊断领域，尤其涉及甲状腺乳头状癌靶向用药相关突变在甲状腺乳头状癌辅助治疗中的用途。

背景技术

甲状腺癌是内分泌系统中最常见的恶性肿瘤,是来源于甲状腺上皮细胞的恶性肿瘤，病理类型主要包括甲状腺乳头状癌(papillary thyroid cancer,PTC)、甲状腺滤泡状癌(follicular thyroid cancer,FTC)、甲状腺髓样癌(me-dullary thyroid cancer,MTC)及甲状腺未分化癌(anaplastic thyroid cancer,ATC)，绝大部分甲状腺癌起源于滤泡上皮细胞，乳头状癌不同亚型预后有差异，但总体预后较好，滤泡状腺癌肿瘤生长较快，属中度恶性，易经血运转移，甲状腺髓样癌较少见，是甲状腺C细胞来源肿瘤，未分化癌最少见，预后很差，平均存活时间3～6个月。甲状腺癌中以乳头状癌在临床上最为多见。

甲状腺结节是内分泌系统的多发病和常见病，临床通过触诊获得的甲状腺结节患病率为3-7％，高分辨率B超检查获得的甲状腺结节的患病率为20-76％，在所有甲状腺结节患者中，约5％-15％的患者为恶性，即甲状腺癌。甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，近年来我国甲状腺癌的发病率呈现增高的趋势，是为数不多的发病率逐年增加的癌症。甲状腺结节良恶性的临床处理不同，对患者生存质量的影响和涉及的医疗花费也有显著差异。因此，甲状腺结节评估的要点是良恶性鉴别诊断，目前甲状腺细针穿刺活检测(FNAB)是良恶性鉴别诊断敏感度和特异度最高的方法，此方法也是中国甲状腺结节和分化型甲状腺癌诊治指南以及美国甲状腺癌患者协会等指南中推荐使用的方法。在良恶性诊断中，病理诊断分子分型十分重要。在结直肠癌患者的临床诊疗过程中，患者除了手术治疗、放化疗、内分泌治疗之外，靶向治疗的科学性和可行性为广大肿瘤患者带来了新的治疗手段。

目前检测基因变异的方法主要有4种：扩增阻滞变异系统PCR(amplificationrefractory mutation system，ARMS-PCR)、荧光原位杂交(Fluorescence in situhybridization，FISH)、一代测序(Sanger双脱氧链终止法)及高通量测序法。

ARMS-PCR法是一种在PCR基础上发展起来用于检测DNA中各种突变的方法，其依据的基本原理是：Taq DNA聚合酶缺少3'到5'外切酶活性，因此对于3'末端错配的引物，以低于正常末端配对引物的速度延伸，当错配碱基的数目达到一定程度或者条件达到一定的严谨程度时，3'末端碱基则因磷酸二酯键形成困难而不能延伸，反应终止，也就得不到特异长度的扩增条带，从而表明模板DNA没有与引物3'末端相应的突变；如果PCR结果能得到特异长度的扩增条带，表明模板DNA上具有与引物3'末端相应的突变。但ARMS-PCR检测技术通常一个体系只能检出一个突变位点，容易出现假阳性。

荧光原位杂交(FISH)基本原理：应用荧光染料标记探针DNA，变性成单链后与变性后的染色体或细胞核靶DNA按照碱基互补的原则进行杂交，形成可被检测的杂交双链核酸，在荧光显微镜下观察并记录结果。但FISH操作复杂，且每次只能检测小量的样本。