[发明专利]用于肉制品中动物种源成分筛查的DNA宏条形码检测靶标序列、检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.用于肉制品中动物种源成分筛查的DNA宏条形码检测靶标序列，其特征在于，DNA宏条形码靶标序列为线粒体16S rRNA基因上的一个片段，在23个目标物种中该片段长度为368bp～384bp，根据不同物种在该片段序列中的差异即可实现区分物种的目的。

2.根据权利要求1所述的DNA宏条形码检测靶标序列，其特征在于，DNA宏条形码靶标序列通过通用引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示对23种动物的基因组DNA扩增获得，其中，序列SEQ ID No.1中碱基M代表简并碱基A/C，碱基Y代表简并碱基C/T，碱基R代表简并碱基A/G；

SEQ ID No.1：5’-MAYAAGACGAGAAGACCCTRTG-3’

SEQ ID No.2：5’-CGGTCTGAACTCAGATCACGTA-3’。

3.用于肉制品中动物种源成分筛查的DNA宏条形码的通用引物，其特征在于，所述通用引物的序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，其中，序列中碱基M代表为简并碱基A/C，碱基Y代表为简并碱基C/T，碱基R按照简并碱基A/G；

SEQ ID No.1：5’-MAYAAGACGAGAAGACCCTRTG-3’

SEQ ID No.2：5’-CGGTCTGAACTCAGATCACGTA-3’。

4.根据权利要求3所述的通用引物，其特征在于，所述动物种源成分的筛查包括对牦牛，普通牛，水牛，山羊，绵羊，马鹿，梅花鹿，猪，驴，马，狗，貉子，狐狸，水貂，猫，兔，豚鼠，小鼠，大鼠，仓鼠，鸡，鸭，鹅的筛查。

5.用于肉制品中动物种源成分筛查的检测试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求3或4所述的通用引物。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，其还包括：Prime STAR GXL DNA酶、dNTPs、5×Prime STAR GXL缓冲液、双蒸水。

7.一种用于肉制品中动物种源成分筛查的检测方法，其包括如下步骤：

S1、提取样品的DNA；

S2、采用上述检测试剂盒对提取的DNA进行PCR扩增；并将扩增产物回收、纯化；

S3、将纯化好的扩增产物构建测序文库，进行二代测序；

S4、将测序结果进行比对或生物信息学分析，确定被检样品的种源成分；其中，动物种源的成分用于包括对牦牛，普通牛，水牛，山羊，绵羊，马鹿，梅花鹿，猪，驴，马，狗，貉子，狐狸，水貂，猫，兔，豚鼠，小鼠，大鼠，仓鼠，鸡，鸭，鹅的筛查。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述PCR扩增的反应体系包括双蒸水11.2μL，0.4μL如SEQ ID No.1所示的正向引物，0.4μL如SEQ ID No.2所示的反向引物，2μLDNA模板；0.4μL的Prime STAR GXL DNA Polymerase；1.6μL的dNTPs；4μL的5×Prime STAR GXL Buffer，其中，正向引物与反向引物的浓度为10μL mol/L。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤S2中，PCR扩增的反应条件为98℃变性10s，60℃退火15s，68℃延伸30s，共30个循环，置4℃保存。

10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤S3中所述生物信息学分析步骤为：

①采用FastQC版号为v0.11.7对测序结果的质量进行分析，包括碱基质量、碱基含量分布、GC含量分布、测序数据平均质量；

②采用AdapterRemoval版号为v2.2.2，去除3'端的接头序列，对数据长度及质量进行过滤；

③根据重叠片段信息，利用FLASH版号为v1.2.11的软件进行短片段拼接；

④使用Cutadapt版号为v3.2，切除两端的引物序列，过滤其余无关序列；

⑤利用Vsearch版号为v2.14.1，去除扩增过程中产生的嵌合序列和冗余序列并过滤长度小于300bp或大于450bp的数据；

⑥经过质控、去冗余、去嵌合体之后，通过NCBI BLAST对结果文件中的代表性DNA序列进行物种注释，相似度最高且在99％以上的物种即为样品内所含种源成分。